目的：定植人体皮肤表面的表皮葡萄球菌（ Staphylococcus epidermidis, S.epidermidis）是一种重要的院内感染条件致病菌。当S.epidermidis在医疗设施中形成生物被膜后，可引起慢性感染和导管相关性感染，难以治愈，已引起医学界广泛关注。研究生物被膜形成机制对其治疗具有指导意义。虽然调控S.epidermidis生物被膜的部分分子和相关机制已被阐释，但激发其生物被膜形成的重要分子尚不清楚。近年来，国外学者研究发现葡萄球菌染色体 mec基因盒（ Staphyloccoccal Cassette Chromosome mec, SCCmec）伴随基因psm-mec能调节耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ Methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA）生物被膜形成。在具有生物被膜形成能力的S.epidermidis标准菌株RP62A培养上清存在PSM-mec多肽，预实验结果显示携带 psm-mec基因的耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Methicillin resistant S. epidermidis, MRSE）具有生物被膜形成能力，提示psm-mec基因可能与MRSE生物被膜相关。但缺乏psm-mec在临床分离S.epidermidis中表达和生物被膜形成的实验证据，psm-mec基因是否参与 MRSE生物被膜形成尚不清楚。因此，本研究旨在分析psm-mec在临床分离S.epidermidis中的表达和特征，通过缺失突变、点突变和过表达 psm-mec基因，观察突变和过表达后 S.epidermidis生物被膜形成及相关性状的变化，探讨该基因与 MRSE生物被膜形成的关系及其机制。　　方法:　　1分析psm-mec与临床分离MRSE生物被膜的关系　　1)携带psm-mec MRSE的筛选与确认：收集临床分离S.epidermidis，通过分子生物学和微生物学方法确认携带psm-mec MRSE。　　2）携带psm-mec MRSE的分子特征：多重PCR分析psm-mec携带株SCCmec型别的多样性；扩增基因间隔序列探讨psm-mec与相邻基因的连接关系；DNA序列比对分析psm-mec及其上游序列的变化；多重PCR分析携带psm-mec MRSE的agr型别，分析psm-mec与agr型别的关系。　　3）psm-mec在MRSE中的表达：提取携带psm-mec MRSE总RNA，采用荧光定量RT-PCR分析临床分离MRSE psm-mec转录表达。　　4）psm-mec与MRSE生物被膜的关系：半定量生物被膜检测法分析携带与未携带psm-mec MRSE生物被膜形成能力，探讨psm-mec与MRSE生物被膜的关系。　　2研究psm-mec缺失突变与MRSE生物被膜的关系　　1）筛选用于构建缺失突变的临床菌株：运用药敏实验、DNA序列分析技术筛选psm-mec上下游序列与S.epidermidis标准菌株RP62A完全一致且四环素和氯霉素敏感的MRSE。　　2）psm-mec缺失突变株的构建：利用融合PCR和温度敏感性穿梭质粒构建同源重组质粒pBT2-Δpsm-mec，经鉴定后电转金黄色葡萄球菌RN4220进行修饰，提取质粒后电转用于构建缺失突变的临床分离MRSE，经同源重组后筛选和鉴定psm-mec缺失突变株。　　3）psm-mec缺失突变与MRSE生物被膜的关系：分析缺失突变株与野生株生物被膜形成能力的差异，验证psm-mec与MRSE生物被膜的关系。　　3探讨psm-mec调控MRSE生物被膜的分子机制　　1）研究psm-mec是通过其RNA和/或蛋白调控生物被膜：　　构建psm-mec过表达株p221（mRNA和蛋白均表达），点突变株pM和pAG（mRNA表达，蛋白不表达），分析这些菌株生物被膜形成能力，探讨psm-mec是在RNA和/或蛋白水平调控S.epidermidis生物被膜。　　2）分析细菌起始粘附与psm-mec诱导生物被膜的关系：　　细菌起始粘附在生物被膜形成中具有重要作用，本实验采用染色法和平板菌落计数法检测p221，pM和pAG菌株起始粘附能力，分析其与psm-mec诱导生物被膜的关系。　　3）探讨eDNA与psm-mec诱导生物被膜的关系：　　胞外DNA（eDNA）在形成和稳定生物被膜中有重要作用，DNase I可降解eDNA。本实验首先观察DNase I对p221，pM和pAG菌株生物被膜的影响，验证eDNA在S.epidermidis生物被膜形成中的作用。分析p221，pM和pAG菌株生物被膜中eDNA的变化，探讨eDNA与psm-mec诱导生物被膜的关系。　　过表达和激活葡萄球菌自溶酶E（autolysin E, atlE）可诱导细菌自溶和eDNA的释放。本实验分析了p221，pM和pAG菌株atlE转录水平，自溶酶活性，Triton X-100诱导的自溶，对溶葡萄球菌酶敏感性的变化，探讨其在psm-mec诱导生物被膜中的作用。　　结果：　　1. psm-mec主要分布于临床分离agr I MRSE　　83.64％的临床分离 S.epidermidis为 MRSE，其中29株携带psm-mec基因，携带率为17.58%，且仅分布于MRSE中。90%携带psm-mec菌株为agr I型MRSE，10%为agr阴性突变株，未见其分布于agrⅡ或Ⅲ型MRSE。提示psm-mec主要分布于agr I MRSE。　　2.携带psm-mec MRSE的分子特征　　携带psm-mec菌株均为class A mec，但ccr分型表现出明显的多样性。多重PCR结果显示携带psm-mec菌株存在8种SCCmec型别模式，且均为混合型，但所有菌株SCCmec中均含有Ⅱ或Ⅲ型片段。psm-mec与相邻基因 mecR1, xylR存在两种连接模式，100%菌株的psm-mec均与mecR1相连，68.97%菌株与xylR相连。所有菌株psm-mec ORF序列无突变，4.34%菌株在psm-mec基因上游SD区存在G>A的点突变。　　3.携带psm-mec MRSE均表达此基因　　Real time逆转录PCR结果显示，临床分离携带psm-mec MRSE均可转录表达psm-mec，其表达水平在103-107拷贝之间，SD区G>A点突变和野生型菌株间psm-mec表达无差异，psm-mec与相邻基因两种连接方式间其表达也无差异，提示psm-mec SD区G>A点突变以及与相邻基因连接方式不影响psm-mec转录表达。　　4. psm-mec与MRSE生物被膜相关　　携带与未携带 psm-mec菌株间生物被膜形成能力差异具有统计学意义，提示psm-mec与MRSE生物被膜相关。SD区G>A点突变和野生型菌株间生物被膜形成能力无差异，psm-mec与相邻基因两种连接方式间其生物被膜形成能力也无差异，提示psm-mec SD区G>A点突变以及与相邻基因连接方式不影响生物被膜形成。　　5. psm-mec缺失突变降低MRSE生物被膜形成　　序列比对和药敏实验筛选和鉴定了3株用于构建psm-mec缺失突变的临床分离MRSE，通过同源重组，筛选和鉴定获得psm-mec缺失突变株。与相应的野生株比较，3株缺失突变株生物被膜形成能力明显降低，提示psm-mec可诱导MRSE生物被膜形成。　　6. psm-mec mRNA调控S. epidermidis生物被膜　　构建了psm-mec过表达株和不同点突变株p221, pM和pAG，并从DNA和RNA水平得到验证。与ATCC12228比较，p221, pM和pAG菌株生物被膜形成能力明显增加，且p221与pM，pAG菌株生物被膜形成能力差异无统计学意义，提示 psm-mec mRNA调控 S. epidermidis生物被膜形成。　　7.eDNA在psm-mec诱导S. epidermidis生物被膜中起重要作用　　DNase I处理明显降低p221, pM和pAG生物被膜形成能力。与ATCC12228比较，p221, pM和pAG菌株生物被膜中eDNA含量明显增加，agr下游分子atlE mRNA表达升高，同时自溶酶活性和TritonX-100诱导的自溶明显增加，这些结果提示psm-mec可能通过细菌自溶释放eDNA诱导生物被膜形成。　　8.psm-mec不影响S. epidermidis起始粘附和溶葡萄球菌酶敏感性　　与ATCC12228相比，p221, pM和pAG菌株的起始粘附能力和对溶葡萄球菌酶的敏感性的差异无统计学意义，提示细菌起始粘附和溶葡萄球菌酶敏感性与psm-mec诱导S. epidermidis生物被膜无关。　　结论：psm-mec主要分布和表达于agrⅠ型且携带具有SCCmec II和（或）III型结构的MRSE，可通过其mRNA上调自溶酶atlE表达并释放eDNA,诱导生物被膜形成。