溢油污染对斑马鱼早期发育的毒性效应及转录组学机制研究

来源 :大连海事大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:element_wq
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近年来,在全球范围内发生的溢油事故中,泄漏的油品类型繁多。原油的理化性质及组分会因地质源和油品类型的不同而有所不同,进而对水生生物产生的影响可能存在一定的差异。目前,尚缺乏基于个体水平、生理水平和转录组学水平等多层面结合针对不同类型原油污染对鱼类早期发育的影响研究。因此,本文选取了两种典型的原油——阿曼原油(轻质原油)和马瑞原油(重质原油)作为受试油品,以硬骨鱼类经典模式生物——斑马鱼(Danio rerio)胚胎作为受试生物,开展120 h急性暴露实验。从形态发育、生理功能、基因表达、高通量转录组学测序(RNA-Seq技术)以及化学分析等多个方面,系统地研究、分析并比较了两种原油水容组分(Water-Accommodated Fractions,WAFs)暴露对斑马鱼早期发育的影响及潜在分子机制。主要研究结果如下:(1)通过阿曼原油和马瑞原油的理化性质发现,两种原油的理化性质差异明显,其中沥青质含量、粘度和密度分别为1.75%和10.73%、13.26和164.90 mm~2?s-1、0.8669g?cm-3和0.9486 g?cm-3。基于紫外分光光度法和气相色谱-质谱联用技术分析可知,马瑞原油WAF溶液中总石油烃(Total Petroleum Hydrocarbons,TPH)和多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,ΣPAHs)浓度分别是阿曼原油的1.54倍和1.28倍。通过各个PAHs组分占比分析可知,两种原油WAFs溶液中均以低分子量PAHs的占比较高,且马瑞原油WAF溶液中萘的占比量显著高于阿曼原油;反之,阿曼原油WAF溶液中高分子量PAHs的占比量显著高于马瑞原油,尤其是3环菲和4环苯并[a]蒽等。此外,阿曼原油和马瑞原油WAF溶液(油载率:25 g?L-1)暴露120 h后斑马鱼胚胎-幼体体内富集的ΣPAHs浓度分别是522.14±173.26 ng?g-1和867.25±237.36 ng?g-1,马瑞原油WAF暴露后斑马鱼体内富集的ΣPAHs浓度是阿曼原油的1.66倍。(2)阿曼原油和马瑞原油WAFs暴露均会诱导斑马鱼胚胎-幼体的存活率和孵化率随着石油烃类化合物浓度的增加呈剂量依赖性下降的趋势。对于存活率,以TPH浓度为基底时,阿曼原油和马瑞原油WAFs暴露120 h的半数致死浓度分别为3.58 mg?L-1和4.30 mg?L-1,或以ΣPAHs为基底时,半数致死浓度分别为5.17μg?L-1和6.81μg?L-1;由此可知,相较于马瑞原油,阿曼原油暴露对斑马鱼胚胎-幼体具有更强的致死效应。并且由孵化率的结果可知,阿曼原油暴露对斑马鱼胚胎孵化能力的影响显著大于马瑞原油。(3)阿曼原油和马瑞原油WAFs暴露均会对斑马鱼胚胎-幼体造成不同程度地剂量依赖性的形态发育延迟和致畸效应。相较于马瑞原油,阿曼原油暴露造成的形态发育延迟程度和致畸效应更严重。此外,结果表明两种原油暴露对斑马鱼胚胎-幼体造成的形态发育延迟和致畸效应均存在一定的相似性,即暴露诱导的发育延迟主要与胚胎延迟孵化或未孵化、鱼鳔充气异常、自发行动缺失、卵黄吸收缓慢以及血液循环停滞等有关;而暴露诱导产生的致畸效应主要与心包积液、脊索弯曲、尾部畸形和脊柱侧凸等有关。(4)阿曼原油和马瑞原油WAFs暴露能够导致斑马鱼胚胎-幼体的心率、心搏量和心输出量这3个主要心脏功能指标的变化呈现剂量依赖性降低的趋势,且阿曼原油暴露造成的心脏功能紊乱要显著高于马瑞原油。相较于心率和心搏量,心输出量对原油暴露更为敏感,可作为评估原油污染诱导鱼类早期发育阶段产生心脏功能紊乱的主要生理指标。通过斯皮尔曼等级相关分析可知,两种原油WAFs暴露后心脏功能指标的变化与高、低分子量PAHs之间均呈现强负相关性;且相较于低分子量PAHs,原油暴露诱导产生的心脏功能紊乱与高分子量PAHs呈现更强的负相关性。这表明不同类型原油暴露对鱼类造成心脏毒性的差异可能主要归因于高、低分子量PAHs组分含量的差异。此外,阿曼原油和马瑞原油暴露均能够诱导ryr2、atp2a2a、atp2a2b、ncx1h和kcnh2等与心肌细胞兴奋-收缩耦联离子通道相关关键基因的表达呈现剂量依赖性下调的趋势,这可能是原油暴露造成斑马鱼胚胎-幼体出现严重的心脏功能紊乱的主要分子调控机制之一。(5)两种原油WAFs暴露均能够诱导斑马鱼幼体出现显著的鱼鳔充气异常率增加和眼睛面积减小的现象,且阿曼原油暴露造成的影响显著高于马瑞原油。通过实时荧光定量PCR技术分析发现,两种原油暴露均能通过抑制anxa5、acta2和hb9等鱼鳔组织层发育调控基因的表达来扰乱鱼鳔的发育与充气过程。此外,原油暴露诱导产生的眼睛面积减小可能与显著抑制了notch1a和notch1b等参与眼睛结构发育的基因表达有关。(6)通过RNA-Seq技术分析发现,阿曼原油和马瑞原油亚致死暴露(油载率:1g?L-1)诱导斑马鱼胚胎-幼体体内分别出现了961个和957个基因差异表达。基于基因功能富集分析可知,两种原油暴露诱导产生的差异表达基因富集的基因本体论GO术语和KEGG通路之间具有高度的相似性。其中,视觉光信号转导和视黄醇代谢是两种原油暴露后斑马鱼胚胎-幼体体内均显著富集通路之一,这表明原油暴露能够通过扰乱视觉光信号转导以及视黄醇代谢等关键基因的表达进而对斑马鱼早期发育阶段造成眼部发育的异常和视觉节律性光动力反应的破坏。此外,原油暴露还能够扰乱斑马鱼胚胎-幼体体内与Ah R介导激活CYP1A信号转导通路、免疫炎症相关通路和类固醇生物合成过程以及其它生物代谢通路等,影响鱼类早期生命阶段胚胎-幼体的发育或代谢过程。本论文的研究结果有助于为后续更准确地评估溢油污染对水生生物产生的毒性效应提供基础实验数据,也为未来可能发生的溢油事故造成的环境影响评估提供较为坚实的理论科学依据。
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