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目的研究CD137-CD137L信号是否通过介导巨噬细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)的生成和活性,从而影响血管平滑肌细胞(VSMC)和动脉粥样硬化钙化的形成。方法1.体外实验:采用巯基乙酸盐腹腔灌洗提取C57BL/6J小鼠腹腔巨噬细胞(PM)。采用组织块贴壁法进行小鼠胸主动脉VSMC原代培养。构建PM-VSMC共培养体系进行下一步实验。实验分成5组:(1)对照组(单独培养VSMC);(2)共培养组(PM-VSMC共培养);(3)CD137L激动对照组(对照组+激动CD137-CD137L信号);(4)CD137L激动共培养组(共培养组+激动CD137-CD137L信号);(5)MMP-9抑制组(共培养抑制MMP-9+激动CD137-CD137L信号)。采用明胶酶谱法检测MMP-9蛋白的活性。RT-PCR和Western blot分别检测各组钙化相关蛋白OPN、Runx-2的m RNA和蛋白表达水平。微量比色法测定各组钙离子浓度及碱性磷酸酶(ALP)活性。Von Kossa和茜素红染色观察各组细胞钙盐沉积程度。2.体内实验:取6~8周龄Apo E-/-小鼠30只,随机分为5组:(1)即对照组(同型对照Ig G2b);(2)巨噬细胞激活组(巨噬细胞诱导剂巯基乙酸盐);(3)对照组+CD137L激动组(重组CD137L蛋白);(4)巨噬细胞激活+CD137L激动组(巨噬细胞诱导剂巯基乙酸盐+重组CD137L蛋白);(5)MMP-9抑制组(巨噬细胞诱导剂巯基乙酸盐+MMP-9抑制剂+重组CD137L蛋白)。HE染色检测各组小鼠主动脉斑块面积大小及形态,Runx-2免疫组化染色检测小鼠主动脉斑块内钙化程度。结果1.重组CD137L蛋白分别刺激PM(激动CD137-CD137L信号)0、6、12、24h后,以12h时MMP-9蛋白表达显著增加(P<0.05),MMP-9活性显著升高(P<0.01)。2.各组VSMC钙化相关蛋白的表达:RT-PCR显示,与共培养组相比,CD137L激动共培养组VSMC中RUNX-2和OPN的m RNA表达水平均明显增高(P均<0.05)。与CD137L激动共培养组相比,MMP-9抑制组VSMC中RUNX-2和OPN的m RNA表达水平均显著降低(P均<0.05)。与对照组相比,共培养组和CD137L激动对照组VSMC中RUNX-2和OPN的m RNA表达水平均不具备统计学意义(P均>0.05)。Western blot显示,CD137L激动共培养组VSMC中RUNX-2和OPN的蛋白表达水平均明显增高(P均<0.01)。与CD137L激动共培养组相比,MMP-9抑制组VSMC中RUNX-2和OPN的蛋白表达水平均显著降低(P均<0.01)。与对照组相比,共培养组和CD137L激动对照组VSMC中RUNX-2和OPN的蛋白表达水平则均不具备统计学意义(P均>0.05)。3.各组VSMC钙离子浓度和ALP活性:与共培养组相比,CD137L激动共培养组VSMC钙离子浓度和ALP活性均显著增高(P均<0.01)。与CD137L激动共培养组相比,MMP-9抑制组VSMC钙离子浓度和ALP活性均显著降低(P均<0.05)。与对照组相比,共培养组和CD137激动对照组VSMC钙离子浓度和ALP活性均不具备统计学意义(P均>0.05)。4.各组VSMC的Von Kossa和茜素红染色:与共培养组相比,CD137L激动共培养组VSMC钙盐沉积明显增多,而MMP-9抑制组VSMC钙盐沉积明显少于CD137L激动共培养组。与对照组相比,共培养组和CD137L激动对照组钙盐沉积无明显改变。5.各组动脉血管染色结果:HE染色显示,巨噬细胞激活+CD137L激动组中小鼠主动脉斑块和坏死核心面积增加最明显,而MMP-9抑制组斑块和坏死核心面积均有所减小。免疫组化染色显示,巨噬细胞激活+CD137L激动组斑块内RUNX-2钙化指标表达程度最高,而MMP-9抑制组斑块内RUNX-2钙化指标表达则有所降低。结论CD137-CD137L信号通过诱导巨噬细胞产生MMP-9,从而调控Apo E-/-小鼠平滑肌细胞和血管钙化的形成。