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补充安全高效补钙剂是解决当前国民普遍缺钙的重要手段,常被废弃的咸鸭蛋蛋清是经济的肽源,本实验室已发现鸭蛋蛋清肽(DPs)具有良好的促钙吸收活性,但其机制尚不明了。本文采用Caco-2细胞模型、翻转肠囊模型、多种动物模型等,借助于分子生物学手段、分子对接技术及波谱学等方法,考察了钙离子通道TRPV6是否为DPs的作用靶标,并探索其作用机制。鉴定并合成了重要的鸭蛋蛋清肽段,研究了含谷氨酸(E)簇、丝氨酸(S)簇短肽的促钙吸收构效关系,以期从细胞水平、分子水平及整体动物水平,揭示DPs高效提升钙生物利用率的作用及机制。主要研究结果如下:1 DPs体外促钙吸收活性及机理在Caco-2单层细胞模型和翻转肠囊模型中,4mg/mL和8mg/mLDPs能够显著提高钙的转运量,且渐趋饱和;在Caco-2悬浮细胞模型中,DPs能够促进细胞外钙离子向胞内转运,促钙吸收活性效果最佳之比率为[Ca2+]o/DPs=4(mM)/4(mg/mL);在5mM草酸(OA),磷酸(PA),锌离子(Zn2+)存在下,Ca2+的转运分别被抑制了 39.07%,47.54%和9.56%,而DPs能拮抗这种抑制作用;TRPV6通道抑制剂2-ABP(10OμM)能够抑制DPs的促钙吸收作用。0.4mg/mL DPs能够显著提高Caco-2细胞中TRPV6、CalbindinD9k和PMCA1b的蛋白表达(P<0.05)。其机制是DPs通过与小肠TRPV6钙离子通道作用,调节钙离子通道相关蛋白表达,发挥其促钙吸收作用。2 DPs活性肽段结构鉴定及DPs/Ca复合物稳定性研究红外光谱、荧光光谱、粒径分析结果显示:DPs与钙的主要结合位点是羧基氧原子,且在结合过程中发生了肽的折叠和小肽、游离氨基酸的聚合。DPs中最丰富的氨基酸为Glu+Gln和Asp+Asn,分别占比12.14%和7.14%,丝氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的含量也高于5%。采用液质联用技术,并结合蛋白质数据库比对,鉴定出了 7条螯合能力较强的肽段:VHQ、VSEE、INE、ILKN、LYAEE、INSW,LSYL。合成的三种四肽,其钙转运能力和螯合能力大小排序均为VHS(p)S(p)>VSEE>VHSS,DPs螯合能力与促钙吸收作用呈正相关。VSEE能作用于TRPV6钙离子通道。体外稳定性研究结果表明:鸭蛋蛋清肽钙复合物在80℃时稳定性良好,且对酸碱稳定性良好,经过胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后,仍能保持50%以上的钙持有率,对消化酶有一定的耐受性。3 DPs在植酸抑制钙吸收模型和低钙饲料模型中促钙吸收作用及机理研究DPs通过拮抗植酸抑制钙吸收作用,能提高矿物质储留率,促进小肠细胞的增殖与分化,增加盲肠壁重,同时DPs能够调节小肠TRPV6钙离子通道中CalbindinD9k基因的表达,促进钙的吸收。DPs在低钙膳食和正常膳食条件均能促进钙的吸收,改善血清、骨骼指标,提高钙的生物利用率。模型组小肠TRPV6钙离子通道蛋白受到DPs或VSEE的调节,VSEE高促钙吸收作用是通过促进钙转运蛋白calbindinD9k的表达得以实现的。且在正常膳食条件下,DPs能有效激活TRPV6通路中的钙转运蛋白calbindinD9k及膜下侧的膜钙泵PMCA1b蛋白,以促进钙的吸收。4 DPs在维甲酸模型和羊膜内注射模型中促进钙生物利用率及机理研究在维甲酸造成的骨质疏松大鼠模型中,DPs能够增强小肠对钙的吸收,血清指标和骨指标相比于模型组显著改善(P<0.05);同时,DPs能够提高小鼠成骨细胞活性,抑制破骨细胞,提高骨质对钙的生物利用率。受精鸡蛋羊膜内注射DPs或VSEE能够促进钙的小肠吸收,提高骨合成活性。鹰嘴豆、扁豆益生元提取物、VSEE+Ca能够促进肠道益生菌的生长,DPs、VSEE对有益菌增殖无贡献,但VSEE能显著抑制有害菌的增殖(P<0.05);单独补充CaCO3会破坏肠道环境,增加肠道内有害菌增殖,联合补充Ca2++扁豆益生元、或者Ca2++DPs、Ca2++VSEE未见有害菌增殖。同时,DPs与VSEE能够像益生元一样提高小肠绒毛面积和杯状细胞直径,增加小肠吸收面积。5 DPs构效关系研究为了探明鸭蛋蛋清肽结构与其促钙吸收活性间的构效关系,在具有良好促钙吸收活性的三种四肽VSEE、VHSS和VHS(p)S(p)的基础上,合成了 27条肽段,研究结果显示:若要具有高促钙吸收活性,对于四肽VSEE而言,其碳端第一位酸性氨基酸的存在是必须的,碳端酸性氨基酸簇如:E簇“EE”对于促钙吸收作用有重要贡献,处于序列中间的丝氨酸S必须磷酸化;对于四肽VHSS,当S位于碳端时,S簇“SS”能够促进钙的转运,且磷酸化能够提升促钙吸收活性。为了明确DPs与TRPV6蛋白的作用,通过同源建模手段得到了 TRPV6蛋白质的结构,通过分子对接软件Moe预测有两个活性结合位点存在:活性位点1位于第5次与第6次跨膜间loop区内;活性位点2位于第1、2次与第3、4次跨膜间的空腔内;将三个四肽VSEE、VHSS和VHS(p)S(p)分别与TRPV6蛋白进行分子对接,结果发现小肽分子主要以氢键、离子键等与TRPV6蛋白发生作用,且作用力大小排序为:VHS(p)S(p)>VSEE>VHSS,这三个肽段与TRPV6作用之后,仍有螯合钙离子的基团存在,提示小肽在钙离子与钙离子通道TRPV6间似乎起到了桥梁作用,能使钙离子顺利通过钙离子通道。