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山药(Rhizoma Dioscoreae)为薯蓣科植物薯蓣的块茎,属多年生缠绕草本植物,其性味甘平,归脾、肺、肾经。其主要功效是益气养阴、补脾肺肾,是卫生部公布的药食兼用植物之一,也是我国保健食品重要原料之一,营养价值和药用价值已逐步被人们发现和认可。作为山药主要活性成分的山药多糖(Chinese Yam Polysaccharides,CYPS)具有多种药理活性,除具有抗辐射、抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、降血脂和血糖,以及调节和提高机体免疫力之外,还具有抗炎症和抗氧化与衰老作用。近年来,越来越多的研究发现,CYPS在心脑血管疾病领域有着重要的研究价值,本课题旨在研究CYPS对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其相关作用机制。目的:本课题通过线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,研究CYPS对大鼠脑损伤的保护作用并探讨其可能的作用机制。方法:1.动物分组及给药健康雄性SD大鼠,SPF级,体质量(200 g±20 g),按体质量随机分为四组,即为假手术组、模型组、2个剂量给药组(CYPS 1 g/k g、2 g/k g)。按实验设计,两个剂量CYPS给药组大鼠每天灌胃1次,连续给药两周,其余两组给予等体积的无菌水。2.动物模型制备CYPS给药组以及模型组大鼠采用改良Lon ga线栓法,内置栓线建立大鼠中动脉闭塞MCAO(middle cerebral artery occlusion)脑缺血再灌注损伤模型。3.脑梗死面积大鼠脑组织冷冻切片,新配置2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染液水浴避光染色,照相,Osiris软件计算每片梗死区面积以及整个脑片的面积,用以计算梗死面积百分率。4.脑组织中氧化指标测定制备脑组织匀浆液,严格按照试剂盒说明书操作过程,测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及谷胱甘肽氧化酶(Glutathione peroxidase,GSH)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。5.脑组织中炎性因子含量检测制备脑组织匀浆液,稀释一定倍数浓度,按ELISA试剂盒操作说明,测定肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)含量。6.采用OGD/R诱导的BV2细胞模型,考察山药多糖对BV2细胞凋亡和生长的影响。7.BV2细胞上清中氧化指标测定按照试剂盒说明书操作过程,测定OGD/R诱导的BV2细胞上清液中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及谷胱甘肽氧化酶(Glutathione peroxidase,GSH)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。8.BV2细胞上清中炎性因子含量检测分离BV2细胞上清,稀释一定倍数浓度,按ELISA试剂盒操作说明,测定肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)含量。9.Ca MMKβ和Nrf2/HO-1信号通路的检测在OGD/R诱导的BV2前1h加入山药多糖,然后将细胞裂解后采用western blot的方法测定Ca MMKβ、Nrf2和HO-1蛋白的表达。10.统计学处理与分析方法:利用SPSS13.0统计软件进行分析,两组数据之间比较采取t检验,实验数据均以平均数±标准差(x±s)表示。结果1.术后24h,大鼠出现明显的脑梗塞,但高剂量和低剂量的大鼠梗死体积与模型组相比,山药多糖组显着降低脑梗死面积。2.相比于假手术组,模型组MDA含量明显增加(P<0.01),GSH、SOD酶活性降低(P<0.01)。与模型组比较,两个剂量CYPS给药组MDA含量减少、GSH、SOD酶活力提升(P<0.01)。3.大鼠山药多糖处理后,脑组织IL-6、IL-1β和TNF-α水平较模型组降低(P<0.05或P<0.01),4.对照组中Ca MMKβ的表达量并无明显变化(棕黄色),与对照组相比,模型组大鼠脑组织中Ca MMKβ表达量下降,给予山药多糖治疗组脑组织中Ca MMKβ表达量有所升高,其中高剂量组与模型组相比具有统计学差异。5.山药多糖的浓度在0.1 mg/m L时能够显著降低OGD/R诱导的小胶质细胞凋亡,与OGD/R组相比具有统计学差异(P<0.05;P<0.01);而在10 mg/m L共孵育时能够促进OGD/R诱导的小胶质细胞凋亡6.我们发现随着浓度的升高SOD、GSH的含量先升高后降低,在0.1 mg/m L时达到最大值,MDA含量先降低再升高,在0.1 mg/m L时达到最低值。差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。7.,我们考察了山药多糖在OGD/R前1h共孵育时对BV2细胞中TNF-α,IL-6和IL-1β含量的影响,我们发现随着浓度的升高,TNF-α,IL-6和IL-1β的含量先降低后升高,在0.1m g/m L时达到最小值,而在10m g/m L时反而三者的含量均与模型组相比均升高,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。8.采用0.1 mg/m L的山药多糖在OGD/R前1h共孵育,Western blot结果发现OGD/R能够显著降低BV2细胞中Ca MMKβ的蛋白水平,而给予山药多糖治疗后,Ca MMKβ的水平得到显著的提高,这与脑缺血再灌注大鼠实验结果一致。9.我们还考察了山药多糖对Nrf2/HO-1信号通路的影响。研究发现山药多糖能够显著提高O GD/R诱导的Nrf2和HO-1的蛋白水平,而在Ca MMKβ蛋白被抑制后,山药多糖无法再提高Nrf2和HO-1的表达,说明山药多糖是通过调节Ca MMKβ的表达进而影响Nrf2/HO-1信号通路的激活。结论:CYPS具有一定的改善大鼠脑缺血再灌注损伤神经功能障碍的作用,可减少脑梗死面积。提高抗氧化酶活性、抑制炎症因子表达、降低脑组织细胞凋亡及CYPS是通过调节Ca MMKβ的表达进而影响Nrf2/HO-1信号通路的激活。