产α-淀粉酶菌株Flavobacterium sp. HSL13的基因组分析及酶学性质初探

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α-淀粉酶即1,4-α-D-葡聚糖水解酶,是一种内切葡萄糖苷酶,它可以水解淀粉内部的α-1,4-糖苷键,水解产物为葡萄糖、糊精和低聚糖。α-淀粉酶是最常见的一类淀粉酶,其在工业上有广泛的应用,如食品加工、饲料、洗涤、纺织、造纸等。由于淀粉酶在工业上的应用极其广泛,其需求量也越来越大,挖掘不同特性的淀粉酶基因应用于工业生产成为了当下的热门。为了获得更多不同特性的淀粉酶基因,研究人员都会从不同的环境中去筛选淀粉酶基因,比如海洋、热泉、冰山等。本研究从海南三亚白鹭公园红树林地分离出14株产淀粉酶的菌株,其中菌株HSL13的淀粉水解能力最强。同时对其进行生理生化特性分析、分子生物学鉴定以及基因组分析,发现此菌株中含有新型α-淀粉酶基因amy2,实现了此基因在毕赤酵母中的异源表达,并初步分析了其相关酶学性质。本研究的主要结果如下:(1)根据菌株产淀粉酶活性以及观察透明圈大小筛选出一株水解淀粉能力最强的菌株HSL13,其产生黄色素,革兰氏染色后在光学显微镜下成红色短杆状,为革兰氏阴性菌。Biolog分析表明,该菌能利用糊精、D-麦芽糖、L-丙氨酸、L-精氨酸等糖类和氨基酸作为碳源进行生长代谢,对梭链孢酸、盐酸胍等化学试剂较敏感。其亲缘关系与约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)较近,初立为Flavobacterium sp.HSL13。(2)通过对Flavobacterium sp.HSL13进行全基因组测序及分析,得知此菌株基因组总长度为5,483,844 bp,GC含量为33.7%,共有4674个蛋白编码基因和124个非编码RNA。根据通用数据库注释分析得知该细菌含有氨基酸代谢、糖代谢、脂类代谢以及其他一些基础代谢的相关蛋白;根据专有数据库注释分析得知其含有丰富的糖苷水解酶,并含有编码α-淀粉酶的基因,从而验证了此菌株有水解淀粉的作用。(3)将来源于Flavobacterium sp.HSL13中的新型α-淀粉酶基因amy2转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中,成功实现了胞外表达。α-淀粉酶amy2最适反应温度为40℃,最适反应p H为5.0,属于低温酸性淀粉酶,在p H 5.0~11.0孵育1 h能保持60%以上的活性;金属离子Co2+、Ca2+对酶活有促进作用;最适条件下测定比酶活为81 U/mg;根据底物特异性测定得知其对可溶性淀粉、玉米淀粉等多种淀粉类底物都有水解效果,可运用于多种淀粉水解工艺中。
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