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背景:瘢痕疙瘩是真皮中成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过量沉积引起的皮肤纤维性良性肿瘤,也是一种由皮肤损伤和刺激引起的异常伤口愈合反应。由于瘢痕疙瘩的具体发病机制尚不明确,限制了临床治疗。现由于其高复发率对外科医生仍然是一个巨大的挑战。早期生长反应因子1(Egr1)作为一种重要的转录因子,已被证实在多种生理病理途径中发挥重要作用,其异常表达与多种人类疾病进程相关,包括癌症、炎症、动脉粥样硬化和一些纤维化疾病等。异常表达的Egr1可能通过调控下游与炎症、免疫反应类型、细胞增殖和凋亡和EMT等相关的靶基因,从而影响瘢痕疙瘩的发病。现已有大量研究证实了瘢痕疙瘩的中TGF-β1/smad信号传导通路的异常高活化。并且也有研究证实了在硬皮病、肺纤维化和结肠炎的动物模型中,TGF-β1可以通过TGF-β1/smad信号通路的上调Egr1的表达,但在瘢痕疙瘩中,TGF-β1/smad信号通路的与Egr1的关系尚未明确。目的:旨在探究人瘢痕疙瘩中TGF-β1/smad信号通路与Egr1的表达变化的相关性,为阐明TGF-β1/smad信号通路与Egr1相互作用的分子机制奠定基础,从而为瘢痕疙瘩治疗提供新理论依据及治疗靶点。方法:本研究以瘢痕疙瘩为研究对象,根据瘢痕疙瘩基因表达谱及Meta分析结果筛选出TGF-β1/smad信号通路及Egr1为我们主要研究的目的基因。采用免疫组化、Western blot及q-PCR等实验方法检测瘢痕疙瘩中Egr1、α-SMA、Col1、Col3及TGF-β1/smad通路中关键目的基因的mRNA及蛋白的表达变化;向人皮肤成纤维细胞(HSF)中加入TGF-β1以构建HSF纤维化模型,运用q-PCR等实验方法,检测TGF-β1诱导HSF纤维化模型中Egr1、α-SMA、Col1、Col3及TGF-β1/smad通路中关键目的基因的mRNA表达变化。结果:1、人瘢痕疙瘩的mRNA表达谱结果:与正常皮肤相比,瘢痕疙瘩中央区域皮肤中有777个基因表达上调,568个基因表达下调;与距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤相比,瘢痕疙瘩中央区域皮肤有962个基因表达上调,464个基因表达下调;与正常皮肤相比,距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤有37个基因表达上调,173个基因表达下调。根据差异基因富集分析发现,差异基因主要包括在细胞外基质形成与降解、胶原代谢过程等信号通路中,并且TGF-β信号通路相关基因存在显著变化。2、人瘢痕疙瘩中的α-SMA、Col1、Col3、TGF-β1/smad通路中关键目的基因及Egr1的mRNA表达变化:(1)三组样本中的α-SMA、Col1、Col3及Egr1的mRNA表达变化趋势一致:瘢痕疙瘩中央区域皮肤显著高于距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤及正常皮肤,距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤显著高于正常皮肤;(2)三组样本中的TGF-β1、Smad3、Smad7与上述mRNA表达变化趋势不一致:TGF-β1的mRNA表达变化趋势为距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤显著高于正常皮肤,瘢痕疙瘩中央区域皮肤高于距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤及正常皮肤但无统计学意义;Smad3的mRNA表达趋势为距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤显著高于瘢痕疙瘩中央区域皮肤及正常皮肤,瘢痕疙瘩中央区域皮肤显著高于正常皮肤;Smad7的mRNA表达趋势为瘢痕疙瘩中央区域皮肤、距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤、正常皮肤无明显差异。3、人瘢痕疙瘩中的α-SMA、胶原、TGF-β1/smad通路中关键目的基因及Egr1的蛋白表达变化(1)人瘢痕疙瘩中α-SMA、TGF-β1/smad通路中关键目的基因的蛋白表达变化:免疫组化结果显示:三组皮肤样本中的α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad2、Smad7的表达主要集中在表皮层及真皮层,其中正常皮肤的真皮层较疏松,散在分布少量细胞;瘢痕疙瘩中央区域皮肤较距瘢痕疙瘩边缘大于3mm的皮肤及正常皮肤组的角质层及真皮层更厚、纤维组织更致密,并且真皮层细胞更为密集,可见瘢痕疙瘩结节分布。瘢痕疙瘩中央区域皮肤中的α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad2、Smad7的表达显著高于距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤及正常皮肤;距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤与正常皮肤的这些细胞因子表达无显著差异。Western blot结果显示:距瘢痕疙瘩边缘小于3mm的皮肤的α-SMA、TGF-β1、Col1、Smad3、Smad2的蛋白表达量均高于正常皮肤组,但瘢痕疙瘩中央区域皮肤与距瘢痕疙瘩边缘小于3mm的皮肤及正常皮肤组的差异不尽相同。(2)人瘢痕疙瘩中胶原蛋白的表达变化:Masson染色结果显示:与瘢痕疙瘩中央区域皮肤相比,距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤组及正常皮肤组的胶原蛋白表达量较少,主要集中在真皮层的纤维组织中,并且胶原蛋白排列松散、规律,胶原蛋白排列大多平行于真皮层;与距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤及正常皮肤相比,瘢痕疙瘩中央区域皮肤具有更致密的胶原蛋白,并且胶原蛋白排列杂乱,有的甚至于垂直于真皮层。(3)人瘢痕疙瘩中的Egr1的蛋白表达变化:免疫组化结果显示:Egr1表达主要集中在表皮层的基底层及真皮层的细胞内;瘢痕疙瘩中央区域皮肤的Egr1的表达显著高于正常皮肤及距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤组,距瘢痕疙瘩边缘大于3mm区域皮肤与正常皮肤无明显差异。Western blot结果显示:瘢痕疙瘩中央区域皮肤的Egr1蛋白表达低于距瘢痕疙瘩边缘小于3mm的皮肤,但高于正常皮肤。3、TGF-β1诱导HSF纤维化模型中α-SMA、Col1、TGF-β1/smad通路中关键目的基因及Egr1的mRNA表达变化(1)TGF-β1与HSF纤维化模型中α-SMA、Col1、TGF-β1/smad通路中关键目的基因及Egr1的剂量效应关系:随TGF-β1浓度的增加,α-SMA、Col1、Smad3、Smad2、Smad7和Egr1的mRNA表达多在小于2ng/ml前呈上升趋势,在大于后2ng/ml呈下降趋势,在TGF-β1浓度为2ng/ml时mRNA表达最高,且均高于对照组(TGF-β1浓度为2ng/ml)。(2)TGF-β1与HSF纤维化模型中α-SMA、Col1、TGF-β1/smad通路中关键目的基因及Egr1的时间效应关系:随时间的增加,α-SMA、Col1、Smad3、Smad2、Smad7和Egr1的mRNA表达多在6h前呈上升趋势,6h后呈下降趋势,在6h时mRNA表达最高,且均高于对照组(时间为0h)。结论:1、人瘢痕疙瘩mRNA表达谱较正常皮肤及距瘢痕疙瘩边缘大于3mm的皮肤出现明显变化,这些差异基因主要包含在细胞外基质形成与降解、胶原代谢过程等信号通路中,并且TGF-β信号通路相关基因表达发生显著变化。2、人瘢痕疙瘩中的细胞外基质发生改变,纤维化标志物和Egr1的表达显著变化,TGF-β1/smad信号通路呈激活状态。3、外源性TGF-β1能够激活细胞模型中TGF-β1/smad信号通路及纤维化标志物的表达,TGF-β1/smad信号通路的激活与Egr1表达呈正相关。安全有效的阻断TGF-β1/smad信号通路,抑制Egr1的表达有望成为瘢痕疙瘩临床治疗的新方法。