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一．电穿孔介导的RbAp46基因稳定转移的白血病细胞系的建立 目的：优化悬浮培养细胞的转染条件，建立RbAp46基因稳定转染的白血病细胞系。方法：比较了两种电击缓冲液的转染效率，在低电压、高电容的条件下，应用电穿孔法将RbAp46转染白血病细胞系U937和K562，经G418筛选以获得单克隆，用PCR检测RbAp46整合，Western blot分析蛋白质表达水平，挑出表达外源RbAp46蛋白水平最高的克隆。结果：电击时间常数τ为10～40ms时，均获稳定转染的克隆。结论：通过优化转染条件，电穿孔法可将RbAp46基因成功转染悬浮培养的白血病细胞系，为研究RbAp46基因对白血病细胞的生物学行为奠定基础。 二．过表达的RbAp46基因在白血病细胞系U937的功能研究 目的：研究过表达的RbAp46基因对白血病细胞系U937生物学特性的影响。方法：用台盼兰拒染法判定细胞活力，细胞计数判定细胞生长速率。将处在对数生长期U937／RbAp46和U937／CMV各以2×10~5／ml浓度接种，加入TPA50ng／ml，同时并以培养基作为空白对照，培养72小时后收集细胞，流式细胞术测定细胞表面分化抗原CD11b的表达，RT-PCR分析p21mRNA的表达，流式细胞术检测细胞周期分布情况。结果：转染RbAp46的U937细胞的生长速率要比对照组低1倍左右。无论TPA诱导与否，RbAp46都能增加U937细胞表面CD11b的表达。相当于对照组，正常条件下，RbAp46转染的细胞p21mRNA水平没有明显增加，细胞在G1期分布增加，但是经TPA诱导后，p21mRNA水平的明显增加，细胞阻滞在G1期。结论：过表达的外源RbAp46基因能抑制U937的增殖，并为细胞分化准备了条件，使细胞更易于启动分化，p21可能参与该过程。 三．四环素调控的RbAp46基因表达系统的建立 目的：在白血病细胞系U937中建立四环素诱导的RbAp46基因表达系统。方法：运用脂质体将质粒pRevTet-On、pRevTRE-Luc和pRevTRE-RbAp46分别转染逆转录病毒的包装细胞PT67以产生逆转录病毒。将逆转录病毒RevTet-On感染U937细胞，经G418筛选，产生抗性细胞，用有限稀释法将U937／Tet-On抗性细胞单克隆化。14天后，克隆逐步形成，在显微镜下标记并移出。再将逆转录病毒RevTRE-Luc瞬时感染这些克隆，培养基中加入强力酶素(Dox)2mg／L或不加Dox，应用荧光素酶报告基因分析试剂盒检测荧光素酶的活性。挑选一株低背景和高诱导倍数的U937／Tet-On克隆，最后将逆转录病毒RevTRE-RbAp46感染这株克隆。结果：在U937中建立四环素调控的RbAp46基因表达系统。结论：建立逆转录病毒整合的U937细胞株，可用四环素及其衍生物精确调控RbAp46基因的表达，为研究RbAp46在白血病细胞系的功能提供一种有力的实验手段。