研究背景与方法:血管的反应性差异很大程度上与其血管平滑肌的多种受体及离子通道的分布类型和分布密度差异有密切关系。平滑肌细胞膜离子通道的活动正常是血管平滑肌兴奋收缩过程起始的关键,也是细胞的兴奋性与膜的稳定性得以维持的保证。K⁺通道分布广泛,是调节血管平滑肌的收缩性与舒张性的主要离子通道。K⁺通道电流微小的改变即可导致膜电位的很大变化,K⁺经K⁺通道跨细胞膜外流,细胞内电位降低,具有细胞膜稳定作用;细胞内电位降低还使电压依赖性钙通道的开放几率降低。K⁺通道也因此成为治疗药物作用的重要靶标之一。K⁺通道是目前已知的亚型（包括功能分型和结构分型）最多的一类细胞膜离子通道。一些通过影响K⁺通道而起作用的药物已逐渐应用于临床。但目前临床上所用的K⁺通道开放药对组织的选择性不够高,在组织特异性和功能多样性方面的一系列问题导致了药物在临床应用过程中的疗效不理想,甚至治疗失败。因此,了解各组织细胞K⁺通道的分布情况和功能状态对研发新药、临床针对性地合理选择药物治疗极其重要。大电导钙激活钾通道(high-conductance Ca²⁺-activated K⁺ channel, BK通道)和电压依赖性钾通道（voltage-dependent K⁺ channel, Kv通道）是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）中普遍存在而且发挥优势作用的两类负载外向型钾电流的K⁺通道。它们不同的通道亚型对细胞功能的调节和影响有所不同,保障了VSMC能对各种不同的刺激做出适当的反应。尽管Kv通道和BK通道在某些血管上的情况已经得到一些研究,但不同部位的血管上的各种K⁺通道的表达和功能还远不清楚。心脏和脑的血液供应受心脏冠状动脉和脑血管平滑肌张力的影响。明确冠状动脉和大脑中动脉平滑肌细胞（SMC）的Kv通道和BK通道的分布差异有助于更好地掌握其生理作用,进一步了解其在不同生理和病理状态的动态调整;为明确Kv通道和BK通道在冠状动脉和大脑中动脉SMC介导多种血管活性物质的调节作用机制以及在多种病理过程中的作用奠定基础;也为研究开发以K⁺通道为靶点的选择性高、副作用少的药物提供新思路、新线索。牛磺酸是人和哺乳动物体内广泛存在的含硫β氨基酸,在心血管组织中含量最丰富。国内外大量研究表明,牛磺酸具有广泛生物学效应,是调节机体正常生理功能的重要物质,对多种情况下病理损伤具有积极的保护作用。在心血管功能异常的病理状态下补充牛磺酸可以对疾病的发生发展起积极防治作用。作为天然内源性物质,与一般化学合成药物不同的是,牛磺酸作用靶点十分广泛,可以通过多环节、多途径调节心血管系统功能,在防治心脑血管疾病方面展示出良好应用前景。许多研究表明,牛磺酸能够通过作用于包括K⁺通道在内的多种离子通道而产生心血管效应,但到目前为止,国内外有关牛磺酸的研究多集中于心肌和骨骼肌。我室前期研究表明,牛磺酸对血管平滑肌收缩和舒张功能的影响与多种K⁺通道有关。本实验中,急性酶解分离成年雄性SD大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC,利用全细胞膜片钳技术记录Kv通道和BK通道的电流,应用单细胞反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法观察Kv通道和BK通道亚型在转录水平的基因表达情况;记录给予牛磺酸后Kv通道和BK通道电流的变化,了解牛磺酸对此两类通道的影响。主要实验结果:一、大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的Kv通道大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的静息电位分别为-28.91±3.93 mV（n = 15）和-30.82±2.79 mV（n = 19）（P>0.05）;膜电容分别为17.66±0.95 pF（n =46）和14.28±1.01 pF（n =42）（P>0.05）。大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的Kv电流约在膜电位正于-40mV开始呈电压依赖性的增加和外向整流特性;电流在除极后约10²0ms达到最大,500 ms内无明显失活,呈延迟整流特性。Boltzmann方程拟合得到大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的Kv通道电流半激活电位（V1/2）分别为-4.39±1.44mV和-9.89±1.72 mV（P<0.05）,斜率因子（K）分别为12.42±1.19和13.03±1.62（P>0.05）;半失活电位（V1/2）分别为-11.78±1.47 mV和-25.77±2.29 mV（P<0.05）,斜率因子（K）分别为14.73±1.54和16.37±2.33（P>0.05）。给予Kv通道阻断药4-氨基吡啶（4-aminopyridine, 4-AP, 3mM）后,通道电流分别被抑制61.2%（n=11）和62.7%（n=12）。国外研究资料表明,Kv通道的Kv1.1、Kv1.2、Kv1.5、Kv1.6和Kv2.1亚型具有延迟整流特性,因此,我们采用单细胞RT-PCR方法检测了这些亚型在大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC转录水平的表达。结果表明,Kv1.2和Kv1.5亚型在大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC均有表达。取甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照,计算各目的基因相对表达量。Kv1.2亚型在此二动脉VSMC的表达分别为94.4±7.59%和98.1±5.08%（P>0.05, n=7）。Kv1.5亚型在此二动脉VSMC的表达分别为87.3±4.20%和80.2±6.06%（P>0.05, n=7）。Kv1.1亚型在大脑中动脉有表达,其与GAPDH的相对值为54.7±3.05%,表达率100%;在冠状动脉偶有弱的表达,其与GAPDH的相对值为37.6%,表达率14.3%。Kv1.1亚型在此二动脉VSMC的表达有显著性差异（P<0.01, n=7）。Kv1.6和Kv2.1亚型在此二动脉VSMC均无表达。二、大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的BK通道大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的BK电流呈电压依赖性,在除极大于+10mV开始呈明显外向整流特性;浴槽液中给予BK通道阻断药四乙胺（tetraethylammonium, TEA,1mM）后通道电流明显降低,峰值电流分别较给药前减小63.4%（n=9）和72.7%（n=8）。采用EGTA作胞内钙的螯合剂,控制胞内钙螯合状态及游离钙浓度,可见大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的BK电流随细胞内游离Ca²⁺浓度增减而升降,具有钙敏感性。BK通道α亚单位在大鼠冠状动脉SMC上的表达为48±8.80%（与GAPDH的相对值）,而在大脑中动脉SMC上的表达为80.9±8.37%（P<0.01, n=7）;BK通道β1亚单位在此二动脉VSMC上的表达相当,与GAPDH的相对值分别为23.5±5.33%和22.7±5.27%（P>0.05, n=7）。三、牛磺酸对大鼠冠状动脉和大脑中动脉Kv通道和BK通道电流的影响1.牛磺酸对大鼠冠状动脉SMC的Kv通道电流的影响牛磺酸在较低浓度（1mM、3mM、10mM）时表现出对大鼠冠状动脉SMC的Kv通道电流的抑制作用,而在较高浓度（40mM、60mM）时表现为增强作用。1mM、3mM和10mM牛磺酸对大鼠冠状动脉SMC上的Kv通道电流有显著抑制作用。在+20mV膜电位,1mM（n=11）、3mM（n=12）和10mM（n=11）牛磺酸使大鼠冠状动脉SMC的Kv通道电流分别降到5.28±0.23 pA/pF、4.47±0.26 pA/pF和4.19±0.28 pA/pF,与给药前（6.29±0.2 pA/pF）相比差异均显著（P<0.05）。在+20mV膜电位,3mM和10mM牛磺酸分别与1mM牛磺酸相比对电流的抑制具有显著性差异（P<0.05）。在+10mV膜电位,3mM和10mM牛磺酸使Kv通道电流从给药前的5.18±0.28 pA/pF分别降到3.71±0.29 pA/pF（P<0.05）和3.72±0.14 pA/pF（P<0.05）。在0mV膜电位,3mM和10mM牛磺酸使Kv通道电流从给药前的4.06±0.24 pA/pF分别降到2.96±0.18 pA/pF（P<0.05）和2.69±0.13 pA/pF（P<0.05）。20mM（n=9）牛磺酸对各膜电位水平的Kv电流均与给药前无显著性差异（P>0.05）。40mM（n=11）和60mM（n=11）牛磺酸对Kv电流具有增强作用。60mM牛磺酸在+10mV和+20mV膜电位的电流幅度分别为6.34±0.54 pA/pF和7.27±0.35 pA/pF,与给药前（5.18±0.28 pA/pF和6.29±0.2 pA/pF）相比均有显著性差异（P<0.05）。2.牛磺酸对大鼠大脑中动脉SMC的Kv通道电流的影响在大鼠大脑中动脉SMC,1mM（n=11）和3mM（n=11）牛磺酸降低Kv电流,且1mM牛磺酸在+10mV（4.18±0.21 pA/pF）和+20mV（4.29±0.18 pA/pF）膜电位对电流的抑制作用与给药前（4.99±0.31 pA/pF和5.94±0.26 pA/pF）相比差异显著（P<0.05）。10mM（n=12）牛磺酸与给药前相比对电流影响不明显（P>0.05）。20mM（n=11）、40mM（n=11）和60mM（n=11）牛磺酸浓度依赖性地增强Kv电流。与给药前（4.99±0.31 pA/pF和5.94±0.26 pA/pF）相比,40mM和60mM牛磺酸在+10mV（5.91±0.25 pA/pF和6.89±0.43 pA/pF）和+20mV（6.87±0.25 pA/pF和7.74±0.28 pA/pF）膜电位的电流幅度差异均具有显著性（P<0.05）。40mM和60mM牛磺酸之间对Kv电流的增强作用在+10mV和+20mV膜电位均具有显著性差异（P<0.05）。3.1mM牛磺酸对大鼠VSMC的Kv通道作用的时间依赖性大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC均显示,给予1mM牛磺酸后1min即可见对通道的抑制作用,给药后5min其作用明显,给药后10min与给药后5min水平相当。而洗脱后5min记录,通道电流可恢复到给药前的90%以上。4.60mM牛磺酸对大鼠VSMC的BK通道电流的影响在大鼠冠状动脉SMC,60mM牛磺酸（n=12）在低膜电位水平（-30mV +10mV）表现为对BK通道电流的增强作用,在-20mV、-10mV和0mV膜电位时BK电流分别为:4.9±0.46 pA/pF、5.35±0.49 pA/pF和6.47±0.6 pA/pF,与给药前（3.29±0.31 pA/pF、3.82±0.35 pA/pF和4.42±0.38 pA/pF）相比差异均显著（P< 0.05）;在高膜电位水平（+40mV-+80mV）表现为对BK通道电流的抑制作用,+60mV、+70mV和+80mV膜电位时BK电流分别为:16.26±1.51 pA/pF、19.81±1.84 pA/pF和24.04±2.24 pA/pF,与给药前（24.26±1.55 pA/pF、29.31±1.86 pA/pF和32.89±2.02 pA/pF）相比差异均显著（P< 0.05）。在大鼠大脑中动脉SMC,60mM牛磺酸（n=9）表现为从-40mV到+40mV膜电位对BK通道电流的增强作用,而膜电位高于+40mV时对BK电流影响不明显,但未产生如冠状动脉平滑肌一样的抑制作用。60mM牛磺酸对BK通道电流的增强作用从-40mV到+10mV膜电位（4.65±1.35 pA/pF,5.18±1.32 pA/pF,5.98±1.4 pA/pF,6.48±1.51 pA/pF,8.2±1.5 pA/pF和10.05±1.43 pA/pF）均与给药前（1.33±0.25 pA/pF,1.74±0.37 pA/pF,1.94±0.46 pA/pF,2.34±0.5 pA/pF,2.84±0.59 pA/pF和3.54±0.52 pA/pF）有显著差异（P< 0.05）。综合以上研究结果,Kv通道和BK通道在大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC上的功能和表达有一定的差异。Kv通道在大鼠冠状动脉SMC的激活与失活阈值均较大脑中动脉SMC高。大鼠冠状动脉SMC的Kv通道亚型主要是Kv1.2和Kv1.5亚型,而大脑中动脉SMC主要是Kv1.2、Kv1.5和Kv1.1亚型。BK通道α亚单位在大鼠大脑中动脉表达高于冠状动脉。对于其他通道亚型的表达,以及各通道亚型在蛋白水平的表达情况仍需进一步的研究,从而明确通道四聚体的分子构成,以证实这些通道亚型在生理及病理条件下在VSMC中确切的功能。高浓度牛磺酸增强大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的Kv通道电流;低浓度牛磺酸抑制大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的Kv通道电流,且具有时间依赖性和可逆性。牛磺酸对大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的BK通道的作用表现不一致。60mM牛磺酸在大鼠冠状动脉SMC表现为负膜电位增强而正膜电位抑制BK电流的双向作用;在大鼠大脑中动脉SMC则仅表现为低于+40mV膜电位增强BK电流作用,高于+40mV膜电位对BK电流无明显影响。牛磺酸对大鼠冠状动脉和大脑中动脉SMC的Kv通道和BK通道的作用具有一定的差异性和多样性,有待于深入研究。