论文部分内容阅读
我国是世界水产养殖大国,养殖规模位居世界前列。但目前的高密度集约化养殖使得病害发生日益频繁,尤以细菌病最为严重,传统的荧光抗体法、酶联免疫分析法均存在背景荧光较高,灵敏度低等缺陷,时间分辨荧光免疫分析法作为一种高灵敏的检测方法已在食品、化学等领域引起重视;课题组首次应用时间分辨荧光免疫分析法检测了产酸克雷伯氏菌,我们在此基础上探索了TRFIA检测致病菌的新方法,主要内容如下:1.建立了双标记TRFIA检测嗜水气单胞菌B18和产酸克雷伯氏菌B12,将致病菌直接包被微孔板,Eu3+-Ig G、Sm3+-Ig G作为检测抗体对其进行检测,嗜水气单胞菌B18和产酸克雷伯氏菌B12检测灵敏度均为1.0×106 cfu/m L,灵敏度较低存在很大的可拓展空间。2.为了进一步提高检测灵敏度,将抗嗜水气单胞菌B18抗体和抗产酸克雷伯氏菌B12抗体包被微孔板,建立了嗜水气单胞菌B18和产酸克雷伯氏菌B12的双抗夹心双标记TRFIA法,通过对包被Ig G、Eu3+-Ig G及Sm3+-Ig G进行优化产酸克雷伯氏菌B12的检测限达到1.0×104 cfu/m L,嗜水气单胞菌B27的检测限为6.0×104 cfu/m L,标准曲线在1.0×104-1.0×107cfu/m L范围内线性良好,相关系数达99%以上,均优于目前常用的荧光抗体法及ELISA法,且特异性好、重复性好、亦可用于实际样品检测。3.利用生物素标记抗嗜水气单胞菌抗体,碱性磷酸酶标记的链霉亲和素与其发生特异反应后,先后加入反应底物二氟苯水杨酸酯,在酶催化作用下,反应产物能够与Tb3+-EDTA生成时间分辨荧光溶液,以此建立的酶放大时间分辨荧光分析法检测嗜水气单胞菌B18。标准曲线在1.0×102-1.0×106cfu/m L范围内线性良好,该方法的灵敏度为1.0×102cfu/m L,优于双抗夹心双标记时间分辨荧光免疫分析法,且特异性好,重复性好,可用于实际样品检测。4.本课题组先期已合成出新型螯合剂DTPA-p AS,但直接与抗体标记,灵敏度较低;本研究在此基础上,通过多聚赖氨酸改进标记比,建立了检测嗜水气单胞菌B18的TRFIA法,灵敏度为1.0×105cfu/m L。