关于酒精对人类胎儿的发育毒性最初报道于1968年，孕妇饮酒会导致胎儿酒精综合症(FAS)。FAS的主要特征是发育延迟、心脏异常、中枢神经系统异常、颅面部特征异常及骨骼缺陷等。据估计，在一般人群中，新生儿的FAS发生率为1.2‰。中枢神经系统是酒精的作用靶标，酒精处理会导致神经管缺陷(neural tube defeots，NTDs)，而NTDs是最普遍的先天性缺陷之一，发生率为0.5-12‰，但对其发病机制尚不清楚。斑马鱼属硬骨鱼，是发育生物学的模式生物之一，已被证明为人类疾病和药物毒性评价的理想动物模型。本研究以斑马鱼为模式动物，研究酒精对斑马鱼早期胚胎发育的影响，试图揭示酒精对胚胎发育的影响机制，以期为人类先天性神经管缺陷的防治提供理论依据，为孕妇杜绝饮酒和优生优育提供科学指导。本研究首先用不同浓度的酒精处理不同发育时期的斑马鱼胚胎，通过系统观察发现，酒精对斑马鱼胚胎发育的影响存在明显的时期和浓度依赖性，3％酒精于dome期开始处理胚胎3h对胚胎的体轴发育影响明显，极易引起轴裂(split axis)，即体轴后部出现分叉，但在近尾部区又合在一起。综合形态学、组织学观察及原位杂交结果发现，轴裂胚胎的体轴后部出现了2条脊索、神经管及2套体节，与人类的神经管缺陷脊柱裂的表型有相似性。通过分析推断，轴裂胚胎2条神经管和2套体节的形成可能是由裂开的脊索诱导的。实验还发现，酒精处理可明显地延迟胚胎的发育，从dome期开始处理3h后，酒精处理胚胎仅处于50％下包期，而正常胚胎发育至接近70％下包，受精后大约11h酒精处理胚胎仍处于原肠胚期，而胚胎细胞的集中延伸运动是该时期的关键事件。为了进一步探寻酒精引起轴裂的致畸机制，利用原位杂交方法研究了酒精处理胚胎中几个发育相关重要基因的表达，结果发现，酒精处理对体轴发育相关基因ntl，MyoD，neurogeninl，tbx6和gsc的表达图式具有明显的影响，特别于受精后大约11h，酒精处理胚胎与正常胚胎上述5个基因的表达图式差异显著，ntl的表达区域在酒精处理胚胎的背部分为两部分，MyoD的表达区域变宽，neurogeninl在腹侧原神经细胞丛中的表达出现分叉，tbx6的表达区域明显变大，且在预定体节板中的表达图式不规则，gsc的表达区域分为两部分，这些结果提示，酒精干扰神经外胚层和中胚层细胞的集中延伸运动，特别是ntl表达细胞不能集中到体轴中线处。而ntl已证明与斑马鱼胚胎的集中延伸运动存在密切关系，是脊索区集中的一个关键调节子，与非经典的Wnt信号通路共同调节斑马鱼身体后部的形态发生。因此可以推断，酒精干扰胚胎细胞的集中延伸运动引起轴裂。文昌鱼是一种头索动物，被认为是现存的最接近于脊椎动物的无脊椎动物，具有许多脊椎动物发育相关基因的同源基因，是研究动物发育机制及脊椎动物起源与进化的典型材料。斑马鱼是研究脊椎动物发育机制的理想动物模型。随着分子水平研究的不断深入，对文昌鱼和斑马鱼发育机制的研究取得了较大进展，发现了一些重要的发育相关基因。但是，动物胚胎发育受动态的、网络化的基因调控，还需要做大量的深入、系统的研究。本研究首次克隆了文昌鱼发育相关基因AmphiMef2、Amphi-mMRLC和hadh2的全长cDNA，并对其进行了演绎蛋白特性分析、进化生物学分析及发育表达研究。为了进一步揭示在进化过程中基因功能的变化，我们又克隆了斑马鱼的Z-MRLC和hadh2基因，并与文昌鱼的同源基因进行了比较研究。本研究为揭示文昌鱼、斑马鱼的发育机制及阐明在生物进化过程中基因功能的变化提供了重要资料。通过对青岛文昌鱼的cDNA文库进行大规模测序，发现了一个与其它物种的肌细胞增强因子2(Mef2)基因的3′端序列具有较高同源性的EST片段，通过设计兼并引物进行RT-PCR，获得了全长cDNA。演绎蛋白的的氨基酸序列分析结果表明，演绎蛋白具有高度保守的MADS和MEF结构域，与MADS家族的其它MEF2成员类似，这两个区域与其它物种的相应区域的氨基酸一致性在90％以上，因此，将该cDNA定名为AmphiMef2。进化生物学分析表明，该蛋白更接近于脊椎动物的同源蛋白，位于脊椎动物分支的基部。肌细胞增强因子2属转录因子MADS家族成员，它能控制脊椎动物肌肉特异基因的表达，但在无脊椎动物中，并非所有的Mef2基因都是肌肉发育所必需的。原位杂交结果显示，AmphiMef2具有明显的时空表达特异性，首先在早神经胚(大约受精后10h)的预定体节中胚层中表达，之后在体节和未分割的预定体节中胚层中表达。但从幼虫早期(24h)开始，前部体节中的表达水平开始下调。36h幼虫期，只在后部体节中检测到它的表达。至48h幼虫期，AmphiMef2在整个体节中的表达消失，其表达区域转移至口前窝(一个与脊椎动物腺垂体同源的器官)，且持续表达至72h幼虫期。实验结果提示，文昌鱼AmphiMef2可能不但参与肌肉发生，而且可能在口前窝的发育或功能发挥中起作用。AmphiMef2是否在文昌鱼生殖内分泌系统中起作用值得进一步研究证实。通过对青岛文昌鱼神经胚cDNA文库进行规模化测序，并借助于RT-PCR，获得了含有504 bp完整开放阅读框的Amphi-mMRLC cDNA序列，该序列编码167个氨基酸。根据GenBank的序列设计引物，利用RT-PCR获得含有519 bp完整开放阅读框的斑马鱼Z-MRLC(Similiar to 19.9 KD myosin light chain isoform 1)cDNA序列，该序列编码172个氨基酸。对这两个cDNA序列演绎蛋白的蛋白质特性分析比较发现，Amphi-mMRLC与Z-MRLC蛋白具有一定的相似性，均具有EF-hand结构域，蛋白质的等电点接近，二级结构中的无规则卷曲比例接近，但是这两个蛋白之间也存在明显的差异，如序列长度、氨基酸组成、磷酸化位点的数量等。序列比对结果表明，Amphi-mMRLC和Z-MRLC演绎蛋白的氨基酸一致性为46％，与爪蟾、牛、鸡、人、褐家鼠及海绵同源蛋白的氨基酸一致性达46％-47％。在构建的系统发生进化树中，文昌鱼Amphi-mMRLC和斑马鱼Z-MRLC序列分别位于无脊椎动物和脊椎动物分支上，基本符合生物进化规律。整封原位杂交结果表明，文昌鱼和斑马鱼的MRLC基因的表达图式存在明显差异。Amphi-mMRLC首先在文昌鱼早神经胚期的预定体节中胚层中表达，随后限定在体节及肌刀中表达，并且这种表达模式持续至72h幼虫期。在文昌鱼整个发育过程中，在非肌刀肌肉组织中未检测到Amphi-mMRLC的表达。但是，在斑马鱼的体节中并未检测到Z-MRLC的表达。Z-MRLC于体节期在心脏原基、头部中胚层中的表达较强，在分化中的内胚层中表达较弱。受精后72h，它的表达限定在心脏、背部主动脉、肠道上皮和耳泡中。由于文昌鱼Amphi-mMRLC与其它无脊椎动物的同源基因均在肌肉组织中表达，因此推断，无脊椎动物的MRLC可能参与肌肉发生。而脊椎动物的MRLC家族具有更多的成员及更广泛的功能。由此可见，MRLC家族成员在进化过程中发生了变化，出现了新的成员和新的功能。羟酰基辅酶A脱氢酶Ⅱ(hadh2)是一种多功能线粒酶，它具有多种生理功能，并与人类一些疾病特别是先天性出生缺陷存在密切关系。hadh2基因突变会造成MHBD(2-甲基-3羟基丁酰CoA脱氢酶)不足，而MHBD不足会引起一种异亮氨酸代谢先天性出生缺陷。通过对青岛文昌鱼cDNA文库进行规模化测序及借助于RT-PCR，我们首次获得了文昌鱼hadh2基因的全长cDNA。为了进一步研究hadh2在文昌鱼和斑马鱼胚胎发育中的作用及其在进化过程中的功能变化，我们根据GenBank中的斑马鱼hadh2序列设计特异引物进行RT-PCR，获得了斑马鱼hadh2片段。通过对文昌鱼和斑马鱼hadh2演绎蛋白的蛋白质特性分析比较发现，二者演绎蛋白的氨基酸序列长度相同，均为260个氨基酸，氨基酸组成略有差异，蛋白质的等电点和分子量几乎相等，均含有保守的结构域，即短链酒精脱氢酶(adh-short)结构域。进化生物学分析表明，文昌鱼hadh2与斑马鱼hadh2的氨基酸一致性达70％，文昌鱼的hadh2位于系统发生进化树脊椎动物分支的基部，与脊椎动物的同源蛋白具有较近的亲缘关系。胚胎整封原位杂交结果表明，文昌鱼hadh2首先于神经胚中期(受精后大约12h)分化中的内胚层和中胚层中表达，之后在内胚层、脏壁中胚层及后部神经管中表达，至30 h幼虫期，其表达限定在肠道上皮和脏壁中胚层中，在神经管中的表达消失，至72h幼虫期，它的表达限定在肠道上皮中。与文昌鱼hadh2相比，斑马鱼的hadh2是一种母源性表达的基因，在原肠胚期表达下调，至晚体节期，hadh2在头部中胚层、内胚层及眼睛中的表达较强，在中枢神经系统中的表达较弱，但在后部神经管中未检测到hadh2的表达。由此可见，hadh2可能在文昌鱼和斑马鱼胚胎发育过程中起重要作用，但是在进化过程中某些功能发生了变化。