【研究背景与目的】疟疾是全球危害最严重的虫媒传染病。脑型疟(cerebral malaria,CM)是恶性疟原虫感染的严重并发症之一。在CM治疗中,除了给予足量足疗程青蒿素类药物杀虫治疗,必要时可以联合使用激素抑制宿主过于强烈的炎症水平。但即使经过积极抗疟治疗,CM死亡率仍高达18%,部分幸存者还遗留有神经系统后遗症。此外,大剂量激素治疗往往伴随着较大的副作用。因此,临床急需更有效、更安全的辅助治疗药物来提高CM治疗的成功率。脑微循环障碍和免疫病理损伤协同造成的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏是CM最主要的病理变化,而活化的疟原虫特异性CD8~+T细胞靶向杀伤脑血管内皮细胞被认为是其主要发病机制之一;另一方面,新的研究证实,巨噬细胞作为宿主固有免疫阶段吞噬疟原虫的主要效应细胞,对CM的发生、发展也具有重要影响。如能通过某种途径适度下调宿主过于强烈的免疫应答,减轻其对脑血管内皮细胞的杀伤活性,并联合其他小分子药物进一步强化对脑血管内皮细胞的保护,有望成为CM辅助治疗的新方法。近年来,程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)作为肿瘤免疫治疗靶点取得的成功给我们的研究带来新的启发,它与配体PDL1结合可诱导重要的免疫抑制信号。课题组前期的研究初步证实PDL1融合蛋白能够降低CD8~+T细胞活化水平,抑制其杀伤功能,进而减轻实验型脑型疟(experimental cerebral malaria,ECM)小鼠BBB损伤程度,减少ECM发病率,但该融合蛋白能否通过对疟原虫感染早期巨噬细胞极化状态以及抗原提呈能力的调节进而影响CM的病程或结局尚不清楚。另一方面,能否找到某种安全性良好且对脑血管内皮细胞具有保护作用的小分子物质,“双管齐下”保护BBB的完整性,也是课题组重要的研究方向之一。课题组发现,褪黑素作为一种自身分泌的胺类物质,具有抗炎、保护血管内皮细胞等多种作用,但其能否在ECM小鼠模型中对BBB发挥保护性作用仍不清楚。因此,本课题拟在前期工作基础上进一步深入研究PDL1融合蛋白是否对疟原虫感染早期巨噬细胞的极化状态具有调节作用;巨噬细胞极化状态的改变对其后续向CD8~+T细胞提呈抗原的能力以及杀伤活性有何影响;并探讨褪黑素是否对ECM小鼠脑血管内皮细胞具有保护性作用,以期探索CM辅助治疗的新思路。【实验对象及方法】第一部分PDL1融合蛋白对ECM小鼠巨噬细胞极化及其抗原提呈能力的影响1.不同极化状态下巨噬细胞表面PD-1表达水平检测:分离、纯化野生型C57BL/6小鼠骨髓巨噬细胞,培养至铺满6孔板,实验分M0未诱导组,诱导M1极化组,诱导M2极化组和对照组。分别用20 ng/ml IFN-γ和100 ng/ml LPS诱导M1极化,用20 ng/ml IL-4诱导M2极化。培养24 h后,流式细胞术检测巨噬细胞在不同极化状态下PD-1的表达水平变化。2.ECM小鼠模型的构建:以1×10~7个伯氏疟原虫ANKA株(Plasmodium berghei ANKA,PbA)感染的红细胞(parasitized-red blood cells,pRBCs)腹腔注射接种6周龄雄性C57BL/6小鼠构建ECM模型。3.PDL1融合蛋白对ECM小鼠感染早期巨噬细胞关键细胞因子分泌水平及体内炎症水平的影响:PbA感染小鼠的当天经尾静脉注射100μl PDL1融合蛋白(1 mg/ml),感染后第4天(4 day post infection,4 dpi)眼球取血,分离血清冻存;并采用差速贴壁法分离、纯化上述实验处理组小鼠脾脏巨噬细胞,采集细胞培养上清冻存。采用MILLIPLEX~?Map Kit检测上述分别收集的小鼠血清和该小鼠巨噬细胞体外培养上清中IFN-γ、IL-1β、TNF-α等15种关键细胞因子水平。4.PDL1融合蛋白对巨噬细胞极化及其向CD8~+T细胞提呈疟原虫抗原能力的影响:分离、纯化野生型C57BL/6小鼠骨髓巨噬细胞,培养至铺满6孔板,分别加入0.5 ng/ml IFN-γ和1×10~7个pRBCs,在诱导巨噬细胞活化、增殖的同时促进其吞噬疟原虫抗原;实验组加入20μg/ml PDL1融合蛋白。继续培养24 h后,ELISA检测细胞培养上清中IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF-α等巨噬细胞极化关键细胞因子水平的变化。再用PBS缓冲液洗板3遍,以去除可能残留的PDL1融合蛋白对CD8~+T细胞的影响;然后向上述已处理巨噬细胞中添加磁珠分选所获的C57BL/6小鼠脾脏CD8~+T细胞,共孵育24 h。继而分离、纯化CD8~+T细胞,用实时定量PCR法(quantitative real time PCR,qPCR)检测CD8~+T细胞穿孔素和颗粒酶B的mRNA表达水平。第二部分褪黑素对ECM小鼠BBB内皮细胞的保护作用及其机制的初步研究1.褪黑素对ECM小鼠脑型疟症状的影响:ECM小鼠从0 dpi至死亡前,每日腹腔注射10 mg/kg剂量的褪黑素,监测小鼠生存时间、原虫血症以及体重等一般指标变化。2.褪黑素对ECM小鼠BBB损伤程度的影响:用伊文思蓝渗出实验、脑含水量实验、脑石蜡切片HE染色、CD31免疫荧光染色和TUNEL染色,检测ECM小鼠BBB开放程度、脑水肿严重程度、BBB内皮细胞凋亡等情况,以综合判断褪黑素对ECM小鼠BBB损伤是否具有保护性作用。3.褪黑素对脑血管内皮细胞凋亡和炎症状态的影响:用bEnd.3内皮细胞系铺满10cm培养皿,加入8 ng/ml IFN-γ和1×10~8个pRBCs以诱导bEnd.3细胞活化、促进其内化疟原虫抗原;实验组加入20μg/ml褪黑素继续培养24 h后,收集bEnd.3细胞,分别采用western blot和qPCR检测凋亡相关分子(包括NF-κB、Bax、Bcl-2)和炎症相关细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)表达水平变化。【实验结果】第一部分PDL1融合蛋白对ECM小鼠巨噬细胞极化及其抗原提呈能力的影响1.不同极化状态下巨噬细胞表面PD-1表达水平检测:巨噬细胞在M0未诱导状态、体外诱导的M1极化或M2极化状态,其表面均表达PD-1,且不同极化状态下PD-1表达水平未见明显差异。2.PDL1融合蛋白对ECM小鼠感染早期巨噬细胞关键细胞因子分泌水平及体内炎症水平的影响:PDL1融合蛋白显著降低了ECM小鼠血清中促炎细胞因子IL-1β的水平,但对血清中其他细胞因子的水平未见明显影响。此外,PDL1融合蛋白对同一时间点ECM小鼠脾巨噬细胞的细胞因子分泌水平也未见明显影响。3.PDL1融合蛋白对巨噬细胞极化及其向CD8~+T细胞提呈疟原虫抗原能力的影响:PDL1融合蛋白显著降低了共孵育模型中巨噬细胞IL-6,IL-12p70和TNF-α的分泌水平,IL-10的分泌水平升高。CD8~+T细胞在与PDL1融合蛋白预处理的巨噬细胞共孵育后,其穿孔素和颗粒酶B的mRNA表达水平明显低于对照组。第二部分褪黑素对ECM小鼠BBB内皮细胞的保护作用及其机制的初步研究1.褪黑素对ECM小鼠脑型疟症状的影响:褪黑素显著延缓ECM小鼠的发病,对ECM小鼠原虫血症和体重变化等指标未表现出明显影响。2.褪黑素对ECM小鼠BBB损伤程度的影响:相比未经褪黑素处理的ECM小鼠,褪黑素处理组ECM小鼠脑实质伊文思蓝渗出显著减少,脑含水量降低,脑微血管中红细胞和淋巴细胞聚集减少,脑血管内皮细胞凋亡减少。3.褪黑素对脑血管内皮细胞凋亡和炎症状态的影响:qPCR检测显示,褪黑素处理后的bEnd.3小鼠内皮细胞系IL-6、TNF-α、NF-κB和Bax的mRNA水平明显降低,Bcl-2的mRNA水平明显升高,IL-1β的mRNA水平与阳性对照组未见明显差异。Western blot实验显示,褪黑素处理后的bEnd.3细胞中NF-κB蛋白水平和Bax/Bcl-2比值均明显低于阳性对照组。【研究结论】本研究在课题组前期工作基础上,进一步证实了在ECM模型中,PDL1融合蛋白呈现出一定的抑制巨噬细胞M1极化的功能;这种效应也在一定程度上减弱了巨噬细胞向CD8~+T细胞提呈疟原虫抗原的能力,从而间接下调了CD8~+T细胞的活化水平,有利于减轻CD8~+T细胞对脑血管内皮细胞的靶向杀伤,保护BBB的完整性,缓解ECM症状,延长ECM小鼠生存时间。另一方面,本研究也初步证实了褪黑素在ECM模型中具有一定的保护性作用,其具体机制可能与褪黑素降低BBB内皮细胞炎症因子表达、抑制内皮细胞凋亡信号有关。总之,本研究为CM的辅助治疗提出了新思路和新方法,在未来的研究中若能与青蒿素类药物联合使用,有望进一步提高CM治疗的成功率。