背景:喉鳞状细胞癌（喉鳞癌）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,在包括山西省在内的中国北方地区高发。经过几十年的努力,喉鳞癌的治疗方式有了长足进展,但5年生存率却无明显提升。喉部解剖位置隐匿,喉鳞癌早期症状不典型,早期诊断不及时,极大地影响了患者的治疗效果和预后。目前,喉鳞癌的诊断主要依靠内窥镜下组织病理学检查,而侵入性的检测方式影响了该项检查的普及及动态评估。因此,在临床上亟待开发一种快速、微创、高灵敏度的诊断方法及有效可靠的生物学标志物。外泌体是活细胞主动分泌的直径为30-150 nm的膜性囊泡,含有亲本细胞来源的蛋白质、脂质和核酸,可被释放到外周循环血液中。血液是临床上常用的、微创且易于重复获取的样本。MicroRNAs（miRNAs）是真核生物体内广泛存在的非编码小RNA,通常在肿瘤中异常表达,作为肿瘤抑制因子或癌基因在肿瘤的发生发展过程中发挥重要调控作用。循环血液中外泌体miRNAs已经在多数肿瘤中被报道可作为潜在的肿瘤标志物,用于肿瘤筛检、病程监测、疗效观察及预后评估等各环节。外周血外泌体miRNAs因外部有膜的包被,可逃避血液中核酸酶的消化,更为稳定,同时不易受到细胞外环境的影响,研究结果更为可靠;而且,外泌体内miRNAs的成分和丰度与总体血液中相比是有差异的,依赖于母体细胞,更能反映母体细胞的功能状态;另外,外泌体内有些miRNAs是富集的,有利于低丰度miRNAs的检出。在喉癌领域,相关的研究很少,我们尚未检索到喉鳞癌外周血外泌体miRNA表达谱的有关报道。本研究拟在高通量测序基础上,建立喉鳞癌血清外泌体miRNA表达谱,鉴定出有意义的血清外泌体miRNA,评估其在喉鳞癌诊断中的应用价值,并探究其在喉鳞癌恶性进程中的生物学功能,为喉鳞癌诊断标志物及治疗新靶点的发现提供参考依据。目的:建立喉鳞癌血清外泌体miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNAs,评估血清外泌体miRNAs对喉鳞癌诊断的监测价值,探究关键miRNA在喉鳞癌恶性进展中的生物学功能。方法:1、血清外泌体提取方法评估收集3例喉鳞癌患者血清,分别采用超高速离心法（UC）、ExoQuick试剂法（EQ）、8%PEG单次沉淀（PEG1）及8%PEG+5%PEG两次沉淀法（PEG2）提取这3例患者的血清外泌体。从提取到的外泌体的形态、粒径、浓度、标志蛋白表达及miRNA表达谱这几个方面来评估这四种方法的优劣。（1）运用透射电镜（TEM）观察外泌体形态与大小;纳米颗粒跟踪仪（NTA）检测粒径及浓度;Western Blot（WB）检测外泌体标志蛋白表达情况。（2）提取外泌体RNA,通过高通量RNA测序获得这四种方法提取到的血清外泌体miRNA表达谱,进行彼此间相关性分析。2、喉鳞癌患者血清外泌体差异miRNAs筛选用ExoQuick试剂提取6例喉鳞癌患者和6例健康对照者血清外泌体。（1）等体积血清提取外泌体后,采用蛋白阵列印迹法分析外泌体相关蛋白表达情况,并用TEM和NTA检测比较两组样本间血清外泌体分泌水平。（2）提取这12例实验对象血清外泌体RNA,进行高通量RNA测序,筛选两组间差异表达的miRNAs,采用miRanda、PITA和RNAhybrid软件预测它们的靶基因,对这些靶基因进行GO和KEGG富集分析。3、喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体内参基因筛选（1）从我们的测序数据和文献报道中选择候选参考基因。从测序数据中选择表达稳定、变异系数小、表达水平适中的miRNAs作为候选参考miRNAs。筛选标准:首先,排除在两组间表达水平有显著差异（P<0.05）的miRNAs,或者TPM值<1的miRNAs;其次,计算每个miRNA在两组中的平均TPM值,排除两组间平均TPM值之比值<0.75或>1.3的miRNAs;最后,计算每个miRNA在所有样本中总的变异系数,将变异系数按从小到大进行排序,选择平均TPM值>50的miRNAs作为候选内参基因。此外,查阅文献后,U6和miR-16-5p也纳入到候选内参基因中。（2）候选内参基因在另一组独立样本中进行qRT-PCR检测,用GeNorm、BestKeeper、NormFinder、Delta Ct和RefFinder等5种算法对候选基因的表达稳定性进行评估。4、差异miRNAs人群验证及受试者工作特征（ROC）曲线分析（1）从测序数据中选择在喉鳞癌患者血清外泌体中上调表达且表达量高（TPM值≥50）的9个miRNAs,在另外50名喉鳞癌患者及25名健康对照者中进行qRT-PCR验证。（2）ROC曲线分析miR-941和miR-27a-5p的诊断效能。（3）分析喉鳞癌组织测序数据中miR-941的表达状况。（4）分析血清外泌体miR-941与喉鳞癌患者病理参数的相关性。（5）分析YM500v3数据库中头颈部鳞状细胞癌及其他多种肿瘤中miR-941的表达状况。5、miR-941对喉鳞癌细胞系功能影响（1）qRT-PCR法检测人喉鳞癌细胞系FD-LSC-1、Tu 686及正常口腔角质细胞系HOK的细胞内和细胞外miR-941表达水平。（2）使用脂质体Lipofectamine 3000分别将miR-941模拟物（mimics）和miR-941拮抗物（inhibitor）转染至喉鳞癌细胞FD-LSC-1和Tu 686中,同时设立mimics NC组和inhibitor NC组作为对照组,采用qRT-PCR检测转染效率。（3）通过CCK8细胞增殖实验和Transwell侵袭实验分析转染miR-941 mimics和inhibitor后FD-LSC-1和Tu 686喉鳞癌细胞的增殖和侵袭能力的变化。结果:1、血清外泌体提取方法评估（1）TEM示四种方法提取到的外泌体都具有典型的杯口状或凹面圆盘状结构;NTA示EQ法获得的最富集囊泡粒径小于150nm,其他三种方法所获得的囊泡峰值粒径大于150nm,其中UC和PEG2法提取的囊泡显示出多个粒径峰,还分离到很多直径大于300nm的颗粒;NTA示EQ法所获得的外泌体浓度最高,其后依次为PEG1、PEG2和UC;WB显示四种方法富集到的外泌体都阳性表达蛋白CD63、CD81和TSG101,但是相同的蛋白上样量,EQ、PEG1法提取的外泌体中这三种蛋白表达量较UC、PEG2法高。（2）高通量RNA测序显示UC、EQ、PEG1、PEG2四法提取到的血清外泌体中检出的miRNAs各有571、1094、1079、896种,对这些miRNAs的表达量进行Pearson相关性分析,彼此间相关系数在0.90以上,相关性很强。2、喉鳞癌患者血清外泌体差异miRNAs筛选（1）蛋白阵列印迹法显示喉鳞癌患者和健康对照者的血清外泌体表达CD81、CD63、Alix、FLOT1、ICAM1、EpCAM、ANXA5和TSG101等外泌体相关蛋白,但不表达细胞污染标志蛋白GM130;TEM下,同等大小视野中喉鳞癌患者血清外泌体数量多;NTA示喉鳞癌患者血清中的外泌体浓度较健康对照者显著增高（P<0.05）。（2）Agilent 2100及微量电泳芯片显示两组样本RNA是以小RNA种类为主,无细胞RNA那样的18S rRNA和28S rRNA片段分布峰。（3）高通量RNA测序后,两组共获得1608个成熟体miRNAs,其中1496个是已知的miRNAs,112个是软件预测的新miRNAs。以|log₂fold change|≥0.5且P<0.05作为差异筛选标准,75个miRNAs的表达水平在两组间是有显著差异的,其中,在喉鳞癌患者中34个miRNAs表达上调,41个miRNAs下调表达。对这些差异miRNAs的靶基因进行GO和KEGG富集分析,GO分析显示这些靶基因主要参与了单有机体进程、定位、细胞成分组织或生物发生、分子功能、结合等生物学途径或功能,KEGG分析显示这些靶基因主要参与MAPK、Ras和FAK等肿瘤相关信号通路。3、喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体内参基因筛选测序数据中共有8个miRNAs入选为候选内参miRNAs,分别是miR-30a-5p、miR-532-5p、miR-181a-5p、miR-425-5p、miR-363-3p、miR-424-3p、miR-181b-5p和miR-181a-2-3p,结合U6和miR-16-5p,这10个候选内参基因经过qRT-PCR验证后,五种算法对它们的表达稳定性进行评估排名,最终miR-30a-5p、miR-532-5p和U6被选用于最佳内参基因组合。4、差异miRNAs人群验证及ROC分析（1）喉鳞癌患者组与健康对照者组间表达水平差异有统计学意义的血清外泌体miRNAs是miR-941（P<0.001）和miR-27a-5p（P<0.01）,这两者表达趋势与测序数据一致,在喉鳞癌患者中是高表达的。剩余7个miRNA在两组间差异无统计学意义。（2）血清外泌体miR-941预测喉鳞癌的的ROC曲线下面积（AUC）是0.797（P<0.001）,95%可信区间为0.676-0.918;miR-27a-5p的AUC值是0.672,诊断效能低,未予以进一步研究。以血清外泌体miR-941的表达水平ΔCt值取5.139为诊断点,对喉鳞癌预测的灵敏度和特异度分别为82%和72%,约登指数最大,为0.54;当取ΔCt界值为5.381时,诊断灵敏度和特异度分别为92%和60%,约登指数为0.52。（3）课题组前期对57例喉鳞癌患者的术后癌组织及其配对癌旁组织进行了转录组测序,miR-941在喉鳞癌肿瘤组织中的表达水平是癌旁组织的2.1倍,差异有统计学意义（P<0.001）。（4）检索公共数据库Ym500v3,在456例头颈鳞癌肿瘤组织和43例正常样本组织中,miR-941在肿瘤组织中的表达是正常组织中的2.38倍（P=0.0014）;同时,miR-941在肺鳞状细胞癌、食管癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤黑色素瘤、肝癌和乳腺癌等多数肿瘤的癌组织中表达水平比正常组织中高。（5）血清外泌体miR-941表达水平在喉鳞癌患者中的声门上型者高于声门型者,T3+T4期者高于T1+T2期者,颈淋巴结转移者高于无转移者,Ⅲ+Ⅳ期者高于Ⅰ+Ⅱ期者,病理中、低分化者高于高分化者（P>0.05）。尽管差异无统计学意义,但仍可发现miR-941表达与喉鳞癌的疾病进展和恶性程度是有一定关联的。公共数据库Kaplan-Meier plotter中头颈鳞癌测序数据的生存分析结果表明,miR-941的高表达与头颈鳞癌患者的不良预后显著相关（P=0.0016）。5、miR-941对喉鳞癌细胞系功能影响（1）FD-LSC-1和Tu 686细胞中miR-941的表达量分别是HOK细胞中的5.51（P<0.01）倍和2.11倍（P<0.01）,FD-LSC-1和Tu 686细胞上清外泌体中miR-941的表达量分别是HOK细胞外泌体中的2.20倍（P<0.05）和5.46倍（P<0.01）。（2）CCK8增殖实验中,过表达miR-941后,miR-941 mimics组细胞生长速度显著快于mimics NC组（P<0.01）,表明FD-LSC-1和Tu 686细胞增殖能力增强;反之,转染miR-941抑制剂后细胞增殖能力随之降低。（3）Transwell侵袭实验中,过表达miR-941后,miR-941 mimics组穿膜细胞数显著多于mimics NC组（P<0.01）,表明FD-LSC-1和Tu 686细胞侵袭能力增强;反之,转染miR-941抑制剂后细胞侵袭能力随之降低。结论:1、ExoQuick试剂法是一种高产量、高效率且省时的血清外泌体提取方法。2、喉鳞癌患者血清中外泌体分泌水平高于健康对照者。两组间血清外泌体miRNAs表达水平有显著差异,差异miRNAs的靶基因主要参与肿瘤相关信号通路。3、miR-30a-5p、miR-532-5p和U6是喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体的最佳内参基因组合。4、血清外泌体miR-941可作为喉鳞癌诊断的潜在肿瘤标志物,也是潜在的喉鳞癌治疗靶标。5、miR-941在喉鳞癌的恶性进展过程中起着促癌基因的作用。