木聚糖酶是一类降解木聚糖分子的一类酶系的总称,内切β-1,4木聚糖酶是降解木聚糖的最主要酶,主要由功能、非功能结构域和连接序列等组成。功能结构域又可分为催化结构域(catalytic domain,CD)、木聚糖结合结构域(xylan binding domain,XBD)等,这些功能区域各自担负着不同的作用。海栖热袍菌分泌的木聚糖酶Xyn A包含有纤维素结合结构域:CBD2。通过空间结构的比对,发现CBD2和黑曲霉木聚糖酶xyn的空间结构相似。再经基因序列比对,发现黑曲霉木聚糖酶中组成活性中心的两个谷氨酸(Glu79、Glu170),其中Glu170距离末端10个氨基酸;CBD2的77位也是Glu,178位是Asp(距离末端也是10个氨基酸)。于是我们推测将CBD2中178位的Asp突变成Glu可能会使CBD2具有一定的催化活性。本实验以海栖热袍菌(T maritima)木聚糖酶基因为模板,设计引物来克隆CBD2基因,并设计一对含有接头区域的引物,用融合PCR的方法,将CBD2中178位的Asp替换成Glu,得到突变基因CBD-26。然后经过酶切酶连和p ET20b载体进行重组,最后转入大肠杆菌中BL21(DE3)中用IPTG进行诱导表达,超声波破碎后收集上清,用Co2+凝胶柱和葡聚糖凝胶纯化后测定蛋白性质。实验结果表明,重组基因p ET20b-CBD-26所表达的蛋白已经具备木聚糖酶的催化活性,Kcat值为0.0192s-1,Km很小,值为0.132mg/ml。酶的半衰期较长,在100℃保温80分钟后仍有80%多的残余酶活。最适PH小于2.2,最适温度大于100℃,因此该酶可以应用于高温、强酸环境。对CBD进行改造,不仅为研究CBD结构域的性质提供了一个途径,也为以后对CBD和酶进行融合的研究开创了一条新的思路。