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第一部分慢性睡眠限制导致小鼠认知功能下降及其与额叶皮质Aβ异常沉积的关系与机制研究目的:慢性睡眠限制(CSR)对人体造成诸多不良影响,其中突出表现是导致认知功能损害。本课题采用慢性睡眠限制方法,研究其对野生型C57小鼠空间认知功能的影响与额叶皮质的淀粉样蛋白(Aβ)沉积情况,检测相应额叶皮质Aβ生成过程的关键环节:淀粉样蛋白前体蛋白(APP)蛋白表达水平、β位点APP分泌酶1(B ACE1)蛋白表达水平、APP的β剪切产物C99蛋白的表达水平以及调节BACE1反意义转录因子(BACE1-AS)和BACE1 m RNA表达水平等,以期发现Aβ异常增多的机制,明确慢性睡眠限制与小鼠额叶皮质Aβ异常沉积的关系。研究方法:研究对象为8月龄野生型C57小鼠。通过缓慢旋转滚筒法构建慢性睡眠限制小鼠模型,实验组设定为滚筒旋转时间20h/d(12:00-8:00),滚筒静止时间4h/d(8:00-12:00);环境对照组设定为滚筒旋转时间12h/d(20:00-8:00),滚筒静止时间12h/d(8:00-22:00)。实验室明暗周期为12h光照/12h黑暗(每天8:00日光灯亮),睡眠限制持续时间为2个月。实验动物分为2组:慢性睡眠限制组(C57SR)、同月龄环境对照组(C57CO)。采用Morris水迷宫测试比较各组小鼠每日逃逸潜伏期、目标象限时间、穿越平台次数。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测和免疫荧光技术(Immuno Fluorescence)比较各组小鼠皮质的Aβ沉积情况;采用蛋白印记(Western Blot)技术比较各组小鼠额叶皮质组织APP、BACE1以及C99蛋白水平的差异;采用荧光定量PCR技术定量检测各组小鼠上述脑区的BACE1-AS和BACE1 m RNA表达水平。结果:1.Morris水迷宫的结果:在空间获得性学习阶段,C57SR小鼠从第2天至第5天逃逸潜伏期均显著长于C57CO小鼠(p<0.001),第5天探查试验,测得C57SR小鼠较C57CO小鼠目标象限停留时间显著缩短(45.13±14.98s vs 66.95±15.67s,p=0.013<0.05),两组小鼠穿越平台次数分别为1.25±0.88次vs 4.12±0.83次(p<0.001);2.与C57CO小鼠相比,C57SR小鼠额叶皮质Aβ浓度显著增高(相对浓度35.11±5.55pg/mg vs 25.27±1.15pg/mg,p=0.002<0.05),免疫荧光成像显示C57SR小鼠额叶皮质Aβ沉积增多(相对沉积量0.177±0.0145/pixel vs 0.122±0.010/pixel,p<0.001);3.Western Blot分析C57SR小鼠与C57CO小鼠额叶皮质APP蛋白无差异(相对表达量24.24±1.34 vs 24.37±1.33,p>0.05);而BACE1、C99蛋白表达量显著增加(相对表达量37.57±3.04 vs 21.53±2.80,p<0.001)(相对表达量26.72±1.23 vs16.17±1.90,p<0.001);4.C57SR小鼠相较C57CO小鼠额叶皮质BACE1-AS表达显著性增加(相对表达量518.31±63.46 vs 242.24±187.22,p=0.034<0.05),同时伴有BACE1 m RNA表达增多(相对表达量1217.71±590.60 vs 447.56±329.00,p=0.043<0.05)。结论:1.慢性睡眠限制引起成年野生型C57小鼠空间认知获得性学习能力下降与探查记忆功能下降,2.额叶皮质Aβ蛋白沉积增多,C99蛋白浓度上升,而APP蛋白总量没有显著变化,提示慢性睡眠限制导致淀粉样蛋白沉积并非由于APP蛋白生成增多,而是β分泌酶活性增多引起;3.通过对BACE1的研究,我们发现慢性睡眠限制导致BACE1水平增高,说明BACE1剪切APP生成Aβ增多是慢性睡眠限制导致Aβ异常沉积的核心环节;4.对调节BACE1转录水平进行研究,我们发现促进BACE1生成的BACE1-AS表达明显增加,同时伴有BACE1 m RNA表达水平升高。研究结果提示慢性睡眠限制通过上调BACE1-AS,而增加BACE1蛋白水平的表达与促进BACE-1活性,从而使得C99蛋白生成增多,进而促进Aβ蛋白生成,最终导致Aβ的异常沉积,引起认知功能下降。我们的研究证明慢性睡眠限制导致Aβ蛋白的异常沉积,该过程与APP蛋白基础水平无明显关联。第二部分慢性睡眠限制导致小鼠额叶皮质神经元线粒体功能障碍和线粒体相关性Aβ浓度增加目的:研究慢性睡眠限制后小鼠额叶皮质神经元线粒体的形态与功能,检测线粒体相关性Aβ浓度,探讨慢性睡眠限制后小鼠额叶皮质神经元线粒体结构损伤、功能下降与线粒体相关性Aβ增多的关系,并研究额叶皮质神经元线粒体相关性Aβ浓度与额叶皮质脑组织中Aβ异常沉积及线粒体相关性APP浓度的关系。研究方法:通过缓慢旋转滚筒法构建慢性睡眠限制2个月小鼠模型(同第一部分)。野生型成年小鼠(8月龄)分为2组:慢性睡眠限制组(C57SR)、同月龄环境对照组(C57CO)。观察各组小鼠额叶皮质神经元线粒体的电镜下超微结构,比较线粒体呼吸链复合物IV浓度、ATP活性、线粒体膜电位等线粒体功能指标。各组小鼠额叶皮质脑区Aβ浓度,以及额叶皮质提取线粒体相关性Aβ和线粒体相关性APP,均采用ELISA技术及Western Blot技术检测其浓度。结果:1.透射电镜结果显示C57SR小鼠与C57CO小鼠相比额叶皮质线粒体结构明显损伤,表现为线粒体肿胀、嵴消失、空泡化;2.与C57CO相比,C57SR小鼠额叶皮质神经元线粒体呼吸链复合物IV浓度下降(相对浓度12.691±1.58pg/mg vs 8.722±0.89pg/mg,p<0.001)、ATP活性降低(相对活性52.965±2.89μmol/L vs 15.416±6.90μmol/L,p<0.001)、线粒体膜电位显著降低(JC-1染色荧光灰度比:3.23±0.38vs 3.90±0.49,p=0.043<0.05);3.相较C57CO小鼠,C57SR小鼠额叶皮质组织分离提取的线粒体相关性Aβ浓度显著增加(相对浓度9.68±0.93pg/mg vs 5.30±1.63pg/mg,p<0.001),且与额叶皮质神经元细胞ATP活性存在相关性(r2=0.7874,p<0.001),与额叶皮质组织Aβ总浓度未达显著相关性(p=0.066),与额叶线粒体相关性APP浓度亦无显著相关性(p=0.084)。结论:1.慢性睡眠限制2月可导致野生型小鼠额叶皮质神经元线粒体结构损伤;2.慢性睡眠限制可导致小鼠额叶皮质神经元线粒体呼吸链复合物IV浓度下降、ATP活性、线粒体膜电位显著降低;3.慢性睡眠限制后,额叶皮质神经元线粒体相关性Aβ含量增加,这种增加与线粒体功能损伤存在相关性;4.为期2个月的慢性睡眠限制后,额叶皮质神经元线粒体内Aβ含量与额叶Aβ浓度以及线粒体相关性APP浓度不存在显著相关性。我们的研究提示,额叶皮质神经元内线粒体损伤参与慢性睡眠限制导致Aβ异常沉积的病理过程;慢性睡眠限制损害神经元细胞内线粒体结构与能量代谢功能,额叶皮质神经元内线粒体相关性Aβ增多可能导致线粒体呼吸功能障碍,这种线粒体功能损伤可能独立于局部组织Aβ及线粒体相关性APP浓度。第三部分修饰IGF-1R对慢性睡眠限制导致小鼠额叶皮质Aβ异常沉积的保护作用与机制目的:研究慢性睡眠限制后成年IGF-1R+/-小鼠与野生型小鼠额叶皮质Aβ的沉积情况,并比较各组小鼠相应皮质Aβ生成的关键蛋白(APP、BACE1、C99蛋白),同时观察各组小鼠体重变化、李氏指数、外周血总IGF-1水平变化情况,探讨慢性睡眠限制条件下IGF-1R信号通路活性下降对额叶皮质Aβ异常沉积的影响其所涉及的机制。研究方法:通过缓慢旋转滚筒法构建慢性睡眠限制(为期2个月,方法同前)成年C57小鼠模型。小鼠(8月龄)分为4组:IGF1R+/-同月龄慢性睡眠限制组(MUSR)、IGF1R+/-同月龄对照组(MUCO),野生型慢性睡眠限制组(C57SR)、野生型同月龄对照组(C57CO)。测量并比较各组小鼠体重(g)、体长(cm)、李氏指数(体重g1/3/体长cm×1000)的差异、外周血总IGF-1水平变化,采用ELISA检测比较各组小鼠额叶皮质的Aβ沉积情况,采用Western Blot技术,比较各组小鼠APP、BACE1以及C99蛋白水平的差异。结果:1.IGF-1R+/-小鼠平均体重、李氏指数较野生型小鼠为低(体重比23.18±0.69g vs 26.77±2.13g,p<0.05;李氏指数比295.12±7.07 vs 303.90±6.39,p<0.05),且MUSR小鼠较C57SR小鼠体重、李氏指数变化无显著性差异;C57SR小鼠较C57CO小鼠体重、李氏指数有所增高,但未达到显著性差异;C57SR小鼠与C57CO血浆IGF-1总量分别为(相对浓度596.40±33.20ng/ml vs 510.40±24.35ng/ml,p<0.001);2.2个月慢性睡眠限制后,MUSR小鼠、MUCO小鼠、C57SR小鼠、C57CO小鼠皮质Aβ沉积浓度分别为(相对浓度22.51±2.53pg/mg vs 19.24±1.65pg/mg vs 35.08±4.81pg/mg vs 25.23±1.00pg/mg,p<0.001);3.2个月睡眠限制后,MUSR小鼠、MU C小鼠、C57SR小鼠、C57CO小鼠额叶皮质APP表达量分别为(28.58±1.52 vs 26.86±2.16 vs 24.24±1.33 vs 24.37±1.32,p>0.05),BACE1蛋白表达量分别为(23.56±1.44 vs 21.59±1.80 vs 37.57±3.03 vs 21.53±2.82,p<0.001)和C99蛋白表达量分别为(19.83±1.85 vs 20.91±2.49 vs 26.72±1.23 vs 17.61±1.89,p<0.001)。结论:1.IGF-1R+/-小鼠表现为天然的低体重和低脂肪比例。为期2月的慢性睡眠限制对成年C57小鼠和IGF-1R+/-小鼠体重和李氏指数的影响不明显;2.与野生型C57小鼠相比,IGF-1R+/-小鼠在为期2个月的慢性睡眠限制条件下,额叶皮质下Aβ蛋白沉积与BACE1表达增加不明显,提示下调IGF-1R信号通路能够抑制BACE1蛋白水平表达和BACE1蛋白活性,从而抑制APP的β剪切,最终减少慢性睡眠限制所致小鼠额叶皮质Aβ异常沉积。