论文部分内容阅读
任豆（Zenia insignis Chun）,为苏木科翅荚木属,是国家二级保护树种。任豆是多用途树种,具有木材材质优良,根系发达,抗性强,适应性强,且叶片富含丰富蛋白质等特性。目前任豆在分子遗传方面的研究较少,尚未有一个稳定、高效的遗传转化体系是限制其发展的原因之一。本文以广西德保任豆种子为材料,比较任豆无菌苗不同部位愈伤组织诱导能力,再以叶片作为外植体材料,探讨影响愈伤组织诱导、不定芽再生及伸长、生根诱导过程中的最佳激素配方;并通过石蜡切片,观察任豆叶片愈伤组织形成及不定芽再生的过程,以研究任豆叶片愈伤组织诱导和分化过程的形态变化及结构特点,首次系统地建立起一整套完整高效的任豆再生体系。此外,在构建的任豆再生体系基础上对任豆遗传转化体系进行初步研究,为未来任豆基因工程育种提供了一定的技术平台。主要结果如下:1、任豆种子最佳灭菌方案为0.1%升汞处理10 min,在该条件下种子污染率为10.67%,发芽率为89.33%。2、分别取萌发20 d的任豆无菌实生苗的上胚轴、下胚轴和叶片作为外植体,接种在统一浓度配比6-BA,IBA和2,4-D的MS培养基中,结果表明叶片愈伤组织诱导能力最强。3、培养基MS+2.4 mg·L-11 6-BA+0.05 mg·L-11 2,4-D+0.1 mg·L-11 IBA,为任豆叶片愈伤组织诱导最佳培养基,诱导率高达62.22%。4、叶片远轴面朝上放置于培养基中,叶片诱导率高达63.33%。叶片的不同部位愈伤组织诱导也不尽相同,叶基部位较叶尖部位诱导率高14.45%外,其诱导速度也最快。在全叶片的愈伤组织诱导未发现不同部位再生能力有明显的梯度变化。5、光照对愈伤组织诱导起抑制作用,叶片在黑暗条件下诱导速度最快,诱导率最高,为62.22%。6、叶片愈伤组织不定芽分化最适培养基为MS+0.25 mg·L-11 IBA+1.8 mg·L-16-BA,分化率达51.11%,芽的数量为7.67;采用不同浓度的GA3探究促进不定芽伸长的最佳浓度,发现GA3为0.8 mg·L-1和1.20 mg·L-1时其平均有效芽数达较高值,分别为7.00和6.33,最大伸长长度分别为3.1 cm和4.2 cm,但不定芽在GA3浓度1.20mg·L-1容易出现玻璃化。7、不定芽在不同光源下分化率不同,其中在蓝色光源和红色光源分化率较高,分别为56.67%和52.22%,但不定芽在红色光源下茎伸长较快,生长效率显著。8、生根诱导过程中,在1/2 MS培养基基础上添加0.1 mg·L-11 NAA及1.0 g·L-1活性炭,效果最佳,生根效率达94.44%。将再生植株进行炼苗,可获得生长一致的苗木。9、石蜡切片观察发现,任豆不同激素配方诱导的愈伤组织,其在细胞结构和物理状态存在明显的差别。任豆叶片愈伤组织大部分起源于叶片的切口处,愈伤的发生过程大致分为4个阶段,9 d左右处于愈伤组织的启动期,21 d后进入分裂期,36d后已经形成明显的分生组织结节,在45 d时已经有芽点出现,继而芽原基不断分裂分化为不定芽。10、以农杆菌菌株EHA105进行介导,愈伤组织作为受体,在OD600值为0.6中侵染8 min,进行2 d的共培养后转入含有300 mg·L-1头孢霉素和12 mg·L-1潮霉素的筛选培养基中培养,通过PCR检测和GUS组织化学染色方法检测得到抗性芽。