Myroilysin是金属蛋白酶M12A家族中新发现的一种来源于细菌的蛋白酶,它能够降解弹性蛋白等多种蛋白质底物。本实验室已经解析了 myroilysin酶原的结构,发现myroilysin在活性中心上方有一个独特“帽子”结构,并且不同于M12A家族蛋白酶使用“天冬氨酸开关”的抑制机制,myroilysin使用“半胱氨酸开关(cysteine-switch)”抑制机制。但是,在该研究中没有得到成熟肢的晶体,因此我们对myroilysin的成熟机制仍然不清楚。为了明确myroilysin的成熟机制,我们通过分析pro-myroilysin的氨基酸序列,发现在前体肽与成熟肽之间存在一个胰蛋白酶的酶切位点(Arg37-Gly38之间)。因此,本研究首先利用胰蛋白酶将在大肠杆菌中重组表达的myroilysin酶原的前体肽切除,结果发现,切割之后的产物具有非常高的蛋白酶活性。本研究随后对该蛋白酶进行了结晶条件的筛选,最终在 0.1 M sodium acetate:acetic acid pH 4.5,1 M ammonium phosphate dibasic的条件中获得了 myroilysin的晶体,其中最好的晶体可以衍射到2.6 A。我们以pro-myroilysin的结构作为模板,利用分子置换的方法解析了 myroilysin蛋白晶体的结构。结构显示,my roily sin中活性中心的锌离子与保守序列HEXXHXXGXXH中的三个组氨酸残基(His140,His144,His150),一个水分子(与Glu141相连)以及来自于Met-turn(SIMHY)的酪氨酸残基(Tyr208)配位。通过与酶原的结构对比可以发现,在酶原激活后,“帽子”结构远离了活性中心,使活性中心暴露出来,并且位于保守序列HEXXHXXGAXH之后的Glu151残基与成熟肽的N端第一个氨基酸Gly38残基形成了一个盐键。不仅如此,原本远离活性中心的Tyr208也成为了锌离子的配体。我们还构建了 Y208F以及Y208A突变体,解析了 Y208F酶原结构,并且发现Y208F的蛋白酶活力只有野生型的1%,而Y208A突变体的蛋白酶活力只有野生型的0.5%,这表明Tyr208对myroilysin的稳定性以及催化特性非常重要。通过与astacin结构比较,我们发现myroilysin和astacin的之间存在很大的差异,除了酶原的抑制机制不同,myroilysin具有独特的“帽子”结构且激活前后发生了较大的改变外,它们酶原的激活机制也不同,astacin是两步激活机制,而myroilysin则是一步激活。正因为如此,myroilysin成熟肽的N端比astacin多一个氨基酸(Gly38),这使得myroilysin比astacin的N端埋得更深,形成的盐键和氢键网络也更稳定。在进一步的热稳定性研究中,我们发现E151A突变体的热稳定性以及蛋白酶活力都远低于野生型,而在astacin中相应的突变体E103A的蛋白酶活力却依旧很高,这表明相比于astacin中的Glu103,Glu151对于myroilysin的结构稳定和催化更为重要。因此,虽然myroilysin被划分为M12A蛋白酶家族,但由于它具有许多不同于其他成员的特征,且M12A家族其他已有结构的蛋白酶主要来自于动物,而myroilysin是首个解析了结构的来源于细菌的M12家族蛋白酶,因此,我们认为,myroilysin应属于M12家族的一个新的细菌亚家族。