研究背景再生障碍性贫血(再障,Aplastic Anemia, AA)发病机理较为复杂,近来逐渐认识到免疫机制紊乱包括T淋巴细胞活化,调节性T细胞抑制在再障发中的作用,目前其已成为再障基础研究方面一个最活跃的领域。而调节性T细胞对再障发病机制的研究尚鲜有报道。红髓脂肪化是再障特征性病理改变。对于再障骨髓中的骨髓组织减少、脂肪组织增多的原因及作用今年来逐渐成为研究热点之一。由于成骨细胞和脂肪细胞共同来源于骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs), BMMSCs作为骨髓基质细胞的起源细胞,BMMSCs及其分化成的细胞在再障发病过程中的作用逐渐引起人们的重视。目前国内外均认为骨髓间充质干细胞成骨分化与成脂分化不是彼此孤立的过程,而是存在着相互制约的平衡关系。目前该领域已成为干细胞生物学研究的热点。大量的研究证实这两种分化机制与多种生长因子、及胞内外信号通路紧密相关。成脂分化的诱导因素常常是成骨分化的抑制因素,反之亦然。如过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (Peroxisome proliferation-activated receptor-gamma, PPAR-γ)是成脂分化的主要的诱导因子,同时它可以抑制细胞的成骨分化。成脂分化与成骨分化是多种信号通路间相互作用的结果,包括BMP、Wnt、 Hedgehogs, Delta/jagged蛋白、FGF、IGF、以及转录因子PPAR-γ(?)Runx2等多条信号通路。目前认为在非Wnt途径中,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)途径具有重要地位。BMPs是研究最早和最有潜力的诱导间充质干细胞成骨分化的细胞因子,其属于转化生长因子β (transform growth factor-β, TGF-β)超家族的成员之一,BMP-2是目前研究的较多且作用明显的成骨因子。近来越来越多的研究发现,BMPs可通过MAPKs,PI3K等通路进行信号转导,这些信号转导通路不直接依赖转录因子Smad的激活,其中BMPs-MAPKs通路是通路中重要的一环。Leptin和Adiponectin是脂肪组织参与免疫调节反应的两个主要的脂肪因子。Leptin对T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞都具有免疫调节作用。免疫细胞受到免疫刺激后,产生细胞因子(尤其是TNF-a)作用于脂肪细胞,使其分泌Leptin,从而达到使免疫信号扩大化的目的。Adiponectin是脂肪细胞表达最丰的激素。主要在天然免疫效应中发挥作用,能抑制髓单核细胞祖细胞的增殖,抑制巨噬细胞的活性。那么调节性T细胞是否可以诱导BMMSCs定向分化,分化方向,可能机制及作用。我们对此进行以下研究,以期从一个新的角度探索再生障碍性贫血的发病机制。目的(1)体外分离、培养、鉴定小鼠BMMSCs,并研究其生物学特点。(2)体外分离、纯化、鉴定小鼠调节性T细胞。(3)调节性T细胞对骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的影响及可能机制。(4)建立免疫相关骨髓衰竭小鼠模型,输注调节性T细胞、BMMSCs,观察其对骨髓脂肪化的影响。方法(1)贴壁筛选法分离纯化BALB/c小鼠BMMSCs,胰酶消化传代,FCM鉴定细胞表型,并在特定诱导剂下诱导向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。(2)磁珠分选法分离纯化BALB/c小鼠脾脏调节性T细胞,用流式细胞仪鉴定其免疫表型。(3)将磁珠分选法分离纯化的BALB/c小鼠脾脏调节性T细胞与BALB/c小鼠BMMSCs共培养72小时,Real-time PCR, Western Blot检测BMMSCs成骨分化和脂肪分化相关基因和蛋白表达的变化；共培养7天后PNPP法测定碱性磷酸酶活性并进行碱性磷酸酶染色,EL1SA法和免疫组织化学染色进行I型胶原检测；共培养14天进行油红O染色检测脂滴的形成及Von Kossa染色观察钙化结节的形成。(4)应用SiRNA技术沉默BMP-2基因,p38MAPK抑制剂SB203580和ERK1/2抑制剂PD98059, PKA抑制剂H-89, Real-time PCR, Western Blot, Elisa.免疫组化方法检测BMMSCs成骨分化和脂肪分化相关基因和蛋白表达的变化,研究BMP-2, MAPKs, cAMP-PKA通路对调节性T细胞对BMMSCs成骨作用影响。(5)C57BL/6小鼠(父本)和BALB/c小鼠(母本)杂交产生CByB6F1小鼠,将F1小鼠γ射线亚致死量照射(4.5Gy)后尾静脉注射母本淋巴细胞,建立免疫相关骨髓衰竭动物模型。比较输注BMMSCs,输注调节性T细胞,输注调节性T细胞和BMMSCs共同输注,空白对照,模型组这五组对骨髓脂肪化的影响。记录白细胞,红细胞,血小板及血红蛋白的变化,股骨切片HE染色观察模型小鼠骨髓脂肪化。结果(1) BMMSCs呈梭形、长梭形或三角形,细胞排列整齐,低倍镜下可呈旋涡状或平行状。FCM检测BMMSCs高表达CD44, CD73, CD90和CD105,低表达或不表达CD14, CD34, CD45及HLA-DR。在适当的诱导条件下,BMMSCs(?)向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。(2)磁珠纯化分离的调节性T细胞表达CD4, CD25和Foxp3。(3)体外培养,BALB/c小鼠BMMSCs与纯化的BALB/c小鼠脾脏的调节性T细胞按1：5比例共培养72小时,调节性T细胞可以明显上调BMMSCs成骨因子(BMP-2、OSX、OCN)在基因和蛋白水平的表达,以BMP-2明显,促进碱性磷酸酶(AKP)和I型胶原的表达,促进AKP活性；减少成脂因子(Adiponectin)在基因和蛋白水平的表达；与正常淋巴细胞共培养相比可以显著减少PPAR-γ, Leptin的在基因和蛋白水平的表达；加入成骨诱导培养基后可促进钙化结节的形成,加入成脂诱导培养基后可抑制脂滴的形成。(4)应用SiRNA技术沉默BMMSCs的BMP-2基因,Real-time PCR检测发现成骨基因OCN、OSX的表达明显减少,成脂基因Adiponectin、PPAR-γ基因明显增加。Western Blot检测蛋白表达也有近似的趋势。Treg细胞作用组p38MARK, ERK1/2的磷酸化水平增高,JNK磷酸化无明显变化,应用p38MAPK抑制剂SB203580和/或ERKl/2抑制剂PD98059,I型胶原和碱性磷酸酶的表达明显受抑,加入成骨诱导基后钙化结节形成受抑,骨桥素(OPN)、骨钙素(OCN)表达减少。Treg细胞作用组cAMP.蛋白激酶A (PKA)水平均较对照组高,应用PKA抑制剂H-89,Treg细胞促进I型胶原形成的作用被明显抑制,BLIS法和免疫组化法得到类似结果。(5) CByB6F1小鼠亚致死量照射后,骨髓衰竭为可逆性,外周血象在第10天开始恢复,约6周恢复至正常水平,而亚致死量照射后经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞的小鼠,外周血象降低为不可逆性,造成不可逆性免疫相关骨髓衰竭。骨髓病理学检查证实骨髓衰竭,免疫相关骨髓衰竭组小鼠髓腔空虚,脂肪组织明显增多,而正常对照组和单独照射组骨髓内均无明显脂肪组织形成。骨髓脂肪化改善效果,共同输注Treg细胞和BMMSCs组和输注BMMSCs组,与输注Treg细胞组有显著差异。结论(1)全骨髓贴壁筛选培养法可简便、高效分离、纯化BMMSCs。所获得的细胞具有BMMSCs特征性的细胞表型及向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化能力。(2)磁珠纯化小鼠脾细胞可得到足量的符合免疫表型的Treg细胞。(3)小鼠Treg细胞能促进BMMSCs成骨相关基因(BMP-2,OCN,OSX)的表达,抑制成脂相关基因(adiponectin,PPAR-γ,Leptin)的表达。(4)小鼠Treg细胞通过BMP-MARKs途径,cAMP-PKA途径促使BMMSCs向成骨方向定向分化。(5) CByB6F1小鼠在亚致死量照射后,骨髓衰竭为可逆性,经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞可诱导不可逆性骨髓衰竭,形成免疫相关骨髓衰竭动物模型,模型动物骨髓脂肪组织明显增多,BMMSCs增殖能力降低,不能传代。经输注BMMSCs,骨髓脂肪化较对照组有显著改善,且共同输注Treg细胞和BMMSCs组效果更为明显。