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犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种高度接触性、致死性传染病。该病传染性强、发病率和死亡率高,并可引起机体免疫抑制,已成为养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护业危害最严重的传染病之一。因此,建立一种快速、特异的检测方法对该病的防控十分重要。本研究旨在制备CDV特异性单克隆抗体,建立基于单克隆抗体的CDV检测方法,同时选择具有中和活性的单克隆抗体制备CD单克隆抗体治疗剂。试验内容包括：实验1：犬瘟热病毒的分离及其核衣壳蛋白基因序列分析从非典型犬瘟热(CD)病犬的肺和肝脏组织中分离犬瘟热病毒(CDV),用RT-PCR方法扩增核衣壳蛋白(N)基因,进行克隆和序列分析。结果表明：该CDV分离株N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%-97.5%之间；在N基因系统发育进化树上,该CDV分离株与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。将N基因插入到原核表达载体pET-28a(+)构建原核表达质粒pET-N,在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62kDa,主要以包涵体的形式存在；用Western blotting分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应。实验2：分泌犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立用纯化的犬瘟热病毒(CDV)免疫BALB/c小鼠,制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选和克隆化,获得5株能稳定分泌CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H11、1D7、2C9、1F8和3G3,抗体亚类分别为IgG2bκ、IgG1κ、IgG2bκ、 IgG1κ和IgGlκ,诱生腹水的抗体效价分别为109、107、106、107和106。细胞染色体分析表明,5株杂交瘤细胞株染色体平均数为88～96条,高于SP2/0骨髓瘤细胞或脾细胞的染色体数；间接免疫荧光试验(IFA)证明,5株单抗均与CDV发生特异性反应；免疫印迹(western blotting)分析,单抗1F8和3G3能特异地识别CDV的N蛋白；在病毒中和试验中,单抗3H11和1D7的病毒中和效价分别为105和106,其它3株单抗则没有中和活性；经ELISA相加试验证实,5株单抗作用的抗原位点不同。实验3：犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立用纯化的犬瘟热病毒(CDV)单克隆抗体1D7作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体1F8作为检测抗体,建立检测CDV的单克隆抗体夹心ELISA方法。优化的试验反应条件为：单克隆抗体1D7的包被浓度为2μg/mL,用10%小牛血清封闭,酶标单克隆抗体1F8的稀释度为1：4000。特异性试验证明,单克隆抗体夹心ELISA方法与犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒1型(CAV-1)和犬冠状病毒(CCV)无交叉反应；敏感性试验显示,该方法检测CDV病毒量的最低限为102TCID50/mL;重复性试验表明,夹心ELISA方法批内、批间变异系数小于5%。该单克隆抗体夹心ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于犬瘟热病毒(CDV)的临床检测。实验4：犬瘟热病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的制备用胶体金标记纯化的单克隆抗体1F8,捕获CDV抗原,将纯化的单克隆抗体1D7和羊抗鼠IgG抗体包被于硝酸纤维素膜(NC膜),分别作为检测线和对照线,制备犬瘟热病毒胶体金免疫层析检测试纸条。优化的试验反应条件为：胶体金标记抗体的最适pH值为8.0,被标记单克隆抗体1F8浓度为18μg/mL,包被于NC膜的抗体1D7和羊抗鼠IgG抗体的浓度分别为1.4mg/mL和2.0mg/mL。用该试纸条可特异地检测犬瘟热病毒,检测CDV病毒量的最低限为103TCID50/mL,与相同单克隆抗体1D7和1F8建立的犬瘟热病毒夹心ELISA检测方法的敏感度相当,在1～5min内可得出检测结果,试纸条简便快速,便于犬瘟热的临床快速诊断。实验5：犬瘟热单克隆抗体治疗剂的制备用病毒中和试验测定5株单克隆抗体的中和活性,3H11和1D7两株单克隆抗体腹水的中和效价分别为105和106。选用中和效价高的1D7单克隆抗体杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,制备犬瘟热单克隆抗体治疗剂。该治疗剂对临床犬瘟热病犬有显著的治疗效果。