L-苯甘氨酸是一种非蛋白质氨基酸，虽不参与蛋白质合成，但它是合成普那霉素、维吉霉素等抗生素的重要前体，也是艾滋病病毒蛋白酶抑制剂和抗癌药物紫杉醇的合成前体。工业上主要采用化学合成法合成苯甘氨酸消旋体，再手性拆分生产D或L-苯甘氨酸，此生产方法成本较高，污染严重。目前，许多化工合成的化合物已可通过生物合成法生产，生物合成法具有原料廉价易得、环境友好、产物纯度较高等优点。本论文研究以搭建L-苯甘氨酸的生物合成途径为主要目的，同时探讨了L-苯甘氨酸生物合成途径的影响因素，希望通过本文研究为L-苯甘氨酸生物合成工艺的开发奠定基础，主要研究内容及结果如下：1、筛选获得扁桃酸氧化酶和以L-苯丙氨酸为氨基供体的L-苯甘氨酸转氨酶，形成盒式循环合成途径根据现有-羟基酸氧化酶家族主要成员乙醇酸氧化酶、扁桃酸脱氢酶和细胞色素b2的结构和功能的关系特点，总结获得扁桃酸氧化酶可能具有的结构特征，通过基于结构的蛋白筛选（序列比对、同源建模和分子对接）过程得到可能具有扁桃酸氧化酶活力的蛋白Hmo，有效减少工作量；通过原核表达和功能验证，成功获得了扁桃酸氧化酶Hmo。Hmo存在于细胞质中，并且以氧气为最终电子受体，能够高效催化扁桃酸产生苯乙酮酸。相比东方拟无支酸菌（Amycolatopsis orientalis）来源的HmoAO，天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）来源的HmoSC具有更高的底物亲和力、催化效率和热稳定性。通过分析Hmo所在基因簇，发现了可能具有L-苯甘氨酸转氨酶活力的蛋白HpgT，并功能性表达和分离纯化来源于A. orientalis的HpgTAO，通过同源建模、分子对接和动力学分析证明HpgTAO以L-苯丙氨酸为氨基供体。HpgTAO将氨基转移到苯乙酮酸后产生一份子的L-苯甘氨酸和一份子的苯丙酮酸，苯丙酮酸作为扁桃酸合酶HmaS的底物，可再次参与到L-苯甘氨酸生物合成中，形成了以L-苯丙氨酸为前体的L-苯甘氨酸盒式循环生物合成途径，此途径对前体具有最高的利用率，是最为理想的L-苯甘氨酸合成途径。但是仅仅将此途径导入到野生型大肠杆菌（Escherichia coli）中，未发现有产物积累。L-苯丙氨酸作为氨基供体和苯丙酮酸供体，它的合成受到反馈抑制和反馈阻遏的严格调控，要实现L-苯甘氨酸的生物合成，须解除L-苯丙氨酸合成途径中的反馈调节。2、在系统代谢水平上构建L-苯丙氨酸基座菌株根据L-苯丙氨酸合成代谢途径的调控特点，从全局出发设计了L-苯丙氨酸基座菌株的系统代谢育种策略，成功构建了高效积累L-苯丙氨酸的菌株E. coli W14(pR15BABKG)。(1)通过温度开关精细控制合成途径中重要基因pheAfbr、aroG15、ydiB、aroK和tyrB的表达，使代谢合成途径更通畅，同时减小延滞期菌体负担，缩短延滞期。通过对六种AroG抗反馈抑制突变体的比较，筛选获得高效率热稳定性突变体AroG15。通过增强基因aroG15、ydiB和aroK的表达，弥补了高效率热稳定性突变体PheAfbr底物亲和力下降的弊端。首次采用了热稳定的高效率突变体组合，打通L-苯丙氨酸合成途径。通过替换tyrB编码区上游的TyrR Box，顺利解除tyrB所受的反馈阻遏。通过温敏启动子PL和PR控制目的基因表达，实现了一步变温开关L-苯丙氨酸合成，克服了延滞期较长和无法使用组成型启动子的问题，同时又不必添加化学诱导剂。(2)降低葡萄糖吸收速率，减少过流代谢。对大肠杆菌葡萄糖吸收系统（PTS系统）进行代谢改造，比较了基因ptsG、ptsI和crr缺失后菌株生长、葡萄糖消耗和乙酸生成的变化。E. coli W2（△crr）具有较低的葡萄糖吸收速率，较低的过流代谢，使比葡萄糖消耗量和比乙酸浓度最低，同时延滞期最短，生物量最高。(3)采用tyrA缺陷型菌株，减少分支酸分流，通过培养基中L-酪氨酸的浓度控制生物量，防止菌体过度生长。通过采用tyrA缺陷型菌株顺利克服菌体过量积累的现象，在发酵到25h左右，L-酪氨酸耗尽，菌体被强制转入平衡期，形成无生长的发酵菌体，有效提高转化率。通过crr—和tyrA—的联合运用，糖酸转化率由E. coli W3110(pR15ABK)的18.8%提升到E. coli W14(pR15ABK)的25%。(4)增强产物L-苯丙氨酸的胞外运输，降低胞内高L-苯丙氨酸浓度对细胞代谢的影响。通过温度开关控制yddG的表达，使yddG的表达量显著提升，L-苯丙氨酸的分泌速率显著增加，胞内浓度显著降低，胞内最终L-苯丙氨酸浓度由原始菌株的0.4g L-1降低到0.3g L-1。E. coli W14(pR15BABKG)糖酸转化率高达25.2%，是理论转化率的93%，仅有少量乙酸（1.06g L-1）生成，L-苯丙氨酸浓度达到47g L-1，是未优化发酵条件下的最高水平，此菌株为L-苯甘氨酸等芳香族化合物的生物合成奠定基础。3、功能性表达L-苯甘氨酸合成基因簇，建立L-苯甘氨酸生物合成方法，将L-苯丙氨酸基座菌株改造为L-苯甘氨酸合成菌株实现了L-苯甘氨酸合成基因簇的温控表达，并整合L-苯甘氨酸合成基因簇到L-苯丙氨酸基座菌株中，首次实现了L-苯甘氨酸的生物合成。比较了L-苯丙氨酸转氨酶基因tyrB、aspC和ilvE缺失对L-苯甘氨酸积累的影响，基因tyrB缺失（E. coli B）可以有效实现L-苯甘氨酸的积累，但此时仍具有较高L-苯丙氨酸浓度。基因tyrB和aspC的缺失（E. coli BC）能够进一步提高L-苯甘氨酸的产率，并有效减少L-苯丙氨酸的合成。扁桃酸合酶活力较低是L-苯甘氨酸生物合成途径的主要限制性步骤，它的活力仅是Hmo的3.8%。通过高拷贝质粒增强hmaS的表达后，L-苯甘氨酸浓度显著增加，同时L-苯丙氨酸和苯丙酮酸产率降低。通过进一步增强hmo和hpgT的表达后，L-苯甘氨酸的产率提升为E. coli B（pBSOT）的211倍，达到48.7mg DCW-1（16mg L-1）。综上所述，本研究首次报道了L-苯甘氨酸生物合成途径的搭建及影响因素，形成了以L-苯丙氨酸为前体的L-苯甘氨酸盒式循环生物合成途径，此途径对前体具有最高的利用率，是最为理想的L-苯甘氨酸合成途径。之后，从系统水平上设计代谢改造策略，构建了L-苯丙氨酸基座菌株，此菌株在以L-苯丙氨酸为指标的发酵中达到了工业应用标准。最后，通过整合L-苯甘氨酸盒式循环生物合成途径到L-苯丙氨酸基座菌株中，首次实现了L-苯甘氨酸的生物合成，并探讨了L-苯丙氨酸转氨酶及扁桃酸合酶活力对L-苯甘氨酸生物合成的影响。本论文研究为L-苯甘氨酸的生物合成工艺的开发奠定了理论基础。