目的：脂肪细胞在能量储存和代谢中发挥着重要的作用，由其所分泌的不同因子具有影响食欲、胰岛素敏感性、炎症反应以及其他生物学通路的作用，具有重要临床意义。肥胖，是慢性代谢综合症的主要病因之一，机体通常处于慢性氧化应激和炎症状态。然而，活性氧在肥胖的发生发展中的作用却一直不清。核转录因子NE-E2相关因子(Nrfs)是启动抗氧化反应元件的转录因子，属于CNC家族的碱性亮氨酸拉链蛋白。在本研究组最新的研究中已证实，Nrf2可以通过调控PPARγ的表达而影响脂肪细胞的形成过程，鉴于Nrf1在结构以及在调控抗氧化酶基因等功能上与Nrf2的相似，以及在不同器官中的独特作用，我们认为其在调控脂肪细胞分化过程中极可能存在与Nrf2相似的功能。因此，我们用含有针对小鼠Nrf1基因的sh-RNA慢病毒，感染小鼠3T3-L1前脂肪细胞系，建立小鼠Nrf1基因沉默的前脂肪细胞系，并进一步研究该基因在脂肪细胞分化和脂肪代谢过程中的作用。　　 砷及其化合物是国际癌症研究机构(IARC)确认的人类致癌物。长期饮用高砷水除可导致砷性皮肤损伤及皮肤癌、内脏肿瘤、心血管疾病外，近年来的流行病学发现，砷中毒还可以导致糖尿病的高发。那么，低浓度砷长期暴露是否可以导致成熟脂肪细胞胰岛素敏感性下降，即胰岛素抵抗，目前，还没有相关机制研究。因此，在本研究中，我们试图探讨低浓度的砷是否可以通过对Nrf1或Nrf2的调控而激活抗氧化酶，进而抑制胰岛素刺激脂肪细胞糖摄取所依赖的ROS信号传导通路，而导致胰岛素抵抗。　　 方法：　　 1、研究对象　　 1)细胞培养　　 小鼠3T3L1前脂肪细胞系购至ATCC。培养时应用含有10％小牛血清(CS)、50 units/ml青霉素和50μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基，于37℃、5％CO2，95％大气条件下培养。　　 2)细胞分化　　 分化诱导剂为：地塞米松(Dexamethasone，简写为Dex)、异丁基甲基黄嘌呤(Isobutylmethylxanthine，简写为IBMX)和胰岛素(Insulin)，上述三者组合而成的诱导剂简称为“DMI”。此外，为加快细胞的分化速度，还可以向DMI中补充添加罗格列酮(Rosiglitazone，简写为Rosi)和吲哚美辛(Indomethacin，简写为Indo)。上述五种诱导剂的组合可简称为“DMIRI”或“All”。含有分化诱导剂的培养基称为“分化培养基”。　　 2、建立Nrf1沉默的3T3L1细胞系MISSION短发卡RNA(shRNA)慢病毒颗粒购于Sigma。按产品手册将针对基因Nrf1(SHVRS-NM-008686)或非针对性的Scramble阴性对照(Scr，SHC002V)的颗粒转导至小鼠3T3L1前脂肪细胞系。转导前24小时，细胞以40-50％的融合率被接种于6孔板。次日，以每孔8μg/ml和2×105TU(Transducing Units，传导单位)的浓度向细胞中分别添加海美溴铵(Hexadimethrine bromide)和病毒颗粒。隔夜孵育后，将含有病毒颗粒的培养基换为含有2μg/ml嘌呤霉素(Puromycin)的新鲜培养基，对细胞进行筛选，建立Nrf1基因沉默和Scr稳定传染的细胞模型。待细胞达到90％融合后，用含有puromycin的培养基将其传代。其中，在进行传导实验之前，先确定于3-5天内可将全部细胞杀死的puromycin的浓度。　　 3、油红染色(Oil-red Stainning)油红染色步骤如下：将细胞培养基弃去，冷PBS冲洗细胞3次，于10％中性缓冲福尔马林(10％neutral-buffered formalin)中固定5分钟，冷PBS再次冲洗细胞3次，并于摇床上连续冲洗5分钟，其间换液2次。弃去PBS后于油红染料中染色30分钟，而后用PBS再次冲洗细胞，上扫描仪扫描。　　 4、蛋白提取、定量与Western Blot免疫印迹法(Western blot)检测上述基因的蛋白表达情况：收集细胞、裂解细胞后，提取总蛋白。核蛋白提取按照试剂盒说明书进行，提取后置于-80℃保存。调整总蛋白或核蛋白浓度一致，进行蛋白电泳。蛋白电泳后，将蛋白转印到PVDF膜上，封闭后分别加入适当比例稀释的一抗杂交，然后加入各自相应的二抗再次杂交。　　 5、mRNA提取与定量Real-time PCR分析应用TRIzol(invitrogen)法进行细胞总mRNA提取。定量Real time PCR操作方法主要步骤如下，逆转录反应：总RNA经MuLV反转录酶和OligodT，dNTP转录为cDNA。充分混合后，首先经25℃，10 min；48℃，60 min合成cDNA，然后于95℃加热5min，终止反应，4℃备用。使用SYBR Green试剂盒(Applied Biosystem)进行Real-time PCR分析。　　 6、急性细胞毒性检测(MTT)细胞按每孔5×104浓度接种于96孔板内，置于细胞培养箱内贴壁24小时，之后倒掉培养液，用含有不同浓度亚砷酸钠(5-50μM)的新鲜培养液继续培养24或48小时，之后用非放射活性细胞增值试剂盒(G5430，美国Promega公司)检测细胞活力，结果用砷暴露组与对照组(不含砷的培养液)的百分比表示，同时制作细胞活性线性图形，并记录LC50(细胞的半数致死剂量)。比较3T3L1细胞Nrf1基因沉默对砷诱导细胞毒性的反应。　　 7、胰岛素敏感性实验AKT磷酸化实验(pAKT-Ser407)与[3H]-2-脱氧葡萄糖摄取([3H]-2-deoxy-D-glucose uptake)实验被用于亚砷酸钠处理的成熟脂肪细胞的胰岛素敏感性实验。　　 8、细胞内GSH表达水平的测定应用BIOXYTECH GSH/GSSG-412试剂盒(Oxis Research)进行总GSH(Glutathione)与GSSG(Glutathion disulfide)分析。　　 9、统计与分析应用统计软件Graphpad Prism5进行数据处理分析与制图。用单因素方差分析(ANOVA)比较各组之间的统计学差异，所有实验结果均来自3个以上平行样品或3次以上重复实验，以P<0.05表示统计学差异显著。　　 结果：　　 1、建立Nrf1基因沉默小鼠3T3L1前脂肪细胞系Real time-PCR结果显示成功建立了Nrf1全型和长型基因沉默的sh-Nrf1-A细胞系与sh-Nrf1-L细胞系。　　 2、sh-Nrf1-A与sh-Nrf1-L细胞抗氧化酶基因表达分析对sh-Nrf1-A与sh-Nrf1-L细胞抗氧化酶基因表达进行分析，Nrf1全型基因沉默可以显著降低细胞中Gclc、Gclm、Nqo1的基因的表达，而不改变HO1的表达：Nrf1长型基因沉默可以降低Gclc、Nqo1的基因的表达，而不改变Gclm、HO1的表达。　　 3、sh-Nrf1-A与sh-Nrf1-L细胞急性细胞毒性实验经5-50μM和5-35μM亚砷酸钠染毒24、48小时后，3种细胞活力均随着亚砷酸钠浓度的增高而逐渐变低，其中Nrf1基因沉默细胞(sh-Nrf1-A与sh-Nrf1-L细胞)对砷暴露表现出敏感性。　　 4、sh-Nrf1-A与sh-Nrf1-L细胞Nrf1蛋白表达Western结果显示Nrf1全型和长型基因沉默的sh-Nrf1-A与sh-Nrf1-L细胞系相应的被沉默的Nrf1蛋白，表达均显著降低。　　 5、sh-Nrf1-A与sh-Nrf1-L细胞脂肪细胞分化相关基因的表达分析sh-Nrf1-A与sh-Nrf1-L细胞的Cebpα、δ、Pparγ、Pparγ1和Pparγ2的基因表达均高于对照Scramble细胞、sh-Nrf1-A细胞的Cebpβ的基因表达高于对照Scramble细胞。　　 6、Nrf1基因沉默3T3L1细胞的分化能力油红染色显示，Nrf1全型和长型基因沉默的sh-Nrf1-A细胞系与sh-Nrf1-L细胞系分化能力增强。　　 7、sh-Nrf1-L细胞分化7天、24小时和8小时过程中脂肪细胞分化相关基因与蛋白的变化Real time-PCR与Western结果显示sh-Nrf1-L细胞分化7天、24小时和8小时过程中，其Pparγ的表达均高于Scramble对照细胞。　　 8、长期砷暴露对脂肪细胞葡萄糖摄取的影响长期低剂量亚砷酸钠暴露可降低成熟脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取，并呈现时间、剂量-效应。　　 9、砷致脂肪细胞ROS的产生长期低剂量亚砷酸钠暴露可增加成熟脂肪细胞内ROS的产生，并呈现剂量-效应。　　 10、砷致脂肪细胞抗氧化基因与蛋白的表达长期低剂量亚砷酸钠暴露可增加成熟脂肪细胞内多种抗氧化酶的基因和蛋白水平的表达，并呈现剂量-效应关系。　　 11、长期砷暴露对脂肪细胞GSH含量的影响长期低剂量亚砷酸钠暴露不改变成熟脂肪细胞内GSH的含量。　　 12、长期砷暴露对脂肪细胞Nrf1与Nrf2基因与蛋白表达的影响长期低剂量亚砷酸钠暴露可以增加Nrf2基因与蛋白的表达，而不改变Nrf1基因的表达，并降低Nrf1蛋白的表达。　　 13、长期砷暴露对脂肪细胞分化与炎性介质基因表达的影响长期低剂量亚砷酸钠暴露可以降低Cebpα、Pparγ1和Pparγ2的基因表达，并增高炎性介质Tnf-α、IL-6、IL-1β、iNos和Cox-2的基因表达。　　 14、长期砷暴露对脂肪细胞IRS-1-p-AKT通路的影响长期低剂量亚砷酸钠暴露可以增强基础水平的p-IRS1-Ser307和p-AKT-Ser473蛋白的表达，降低基础水平的p-PI3K的蛋白表达，使成熟脂肪细胞的胰岛素敏感性下降。　　 15、长期砷暴露对脂肪细胞Glut1与Glut4 mRNA表达的影响长期低剂量亚砷酸钠暴露不改变基础水平的Glut1基因表达，而降低Glut4表达。　　 结论：　　 1、成功获得Nrf1全型和长型基因沉默的小鼠3T3L1前脂肪细胞模型，且核转录因子Nrf1参与调控抗氧化酶和分化相关基因的表达。　　 2、Nrf1基因沉默可通过提高前脂肪细胞中Pparγ的表达而增强分化。　　 3、长期低剂量亚砷酸钠暴露通过提高抗氧化酶的表达而抑制胰岛素刺激的脂肪细胞糖摄取，导致胰岛素抵抗。