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水稻抗白叶枯病基因Xa23是从我国普通野生稻（Oryza rufipogon）中鉴定出来的优良基因,对国内外鉴别菌系表现为高抗、完全显性和全生育期抗病。为了克隆Xa23基因,本实验室构建了含2562个单株的F2作图群体,并将Xa23定位在水稻第11染色体长臂上。 本文针对Xa23基因的进一步分子定位和克隆,开展了系列研究,取得了主要结果如下: 1.选取第11染色体长臂G257至G1465区间的15个RFLP探针进行亲本间多态性分析,共6个标记在亲本之间存在多态性,其中探针C1003A距Xa23基因最近,两者间遗传图距为0.4cM。 2.由于分子标记辅助选择育种的需要,将标记C1003A转化为STS标记STS03,为育种学家提供稳定、方便的分子标记。 3.以CBB23黄化苗为材料,以pYLTAC68HB为载体,构建了TAC基因组文库。该文库由68736个克隆构成,插入片段平均大小为32kb,约覆盖水稻基因组5.1倍。 4.根据国际水稻基因组测序计划公布的水稻日本晴第11染色体长臂上的测序结果,本研究以C1003A序列和RM206引物信息进行BLAST比对,建立了跨Xa23基因等位位点的跨叠克隆群。以跨叠克隆群序列设计特异引物31对,经PCR扩增获得了更紧密连锁的标记A89a2、AK601、CF20和A83b4。其中A89a2和AK601与C1003A均位于Xa23的近着丝粒一侧,而CF20和A83b4位于另一侧,这些标记距Xa23基因的遗传距离分别为0.4、0.2、0.2和0.4cM。 5.利用IR24和CBB23杂交构建的共1076个单株的F2群体,菌系P6鉴定表明,F2群体的抗感反应非常清晰。将标记STS03和A83b4进行全部F2植株的检测,表明将Xa23定位于标记STS03和A83b4之间是正确的。由于JG30和IR24有着不同的遗传背景,筛选了在JG30/CBB23之间没有多态性的引物,又获得了4个更紧密连锁的标记,分别是A8A、A8C、CF6、LJ478。将在标记STS03和A83b4之间发生交换的F2植株种植其F3代家系,接种鉴定表明F3代群体的抗/感分离比例完全符合预期值。结合JG30/CBB23群体的定位结果,将Xa23定位于标记AK601和CF20之间。 6.将BAC克隆608用Sau3A I内切酶不完全消化连接到表达载体pCAMBIA130和pYLTAC747HB,构建了两套亚克隆文库,分别挑取了重组子396个和200个,其插入外源片段大小分别为为6～12kb和10～25kb。 7.使用RiceGAAS软件对阳性BAC克隆序列进行基因预测,确定ORF4、5、6、7和8是候选基因。筛选pCAMBIA亚克隆文库,获得了分别包含有ORF4、5、7和8完整序列的表达载体克隆,其中ORF6编码区较大,没有获得包含完整序列的克隆。经农杆菌遗传转化共获得了转ORF4、5、7和8的共1180株的转基因植株,经菌系P6接种鉴定表明这些转基因植株均没有抗性。 8.使用RNAi载体pCK303构建了候选基因的7个RNAi载体,将不同ORF的RNAi载体遗传转化到携有Xa23的粳稻中野19号和籼稻CBB23,目前已经获得了转RNAi植株,有待于进一步接种鉴定。