研究背景肺癌是全世界范围内男性和女性癌症死亡的主要原因,每年有近百万人死于肺癌。在2012年,有182万全球新发病例,156万人死于肺癌,占癌症死亡人数的19.4%。肺癌发病率最高的三个地区分别是北美、欧洲、东亚,2012年发现有超过三分之一的新发病例发生在中国。临床数据表明,原位癌治愈率接近100%,Ⅰ期肺癌患者的5年生存率达60%-90%,而Ⅲb和Ⅳ期患者的5年生存率仅5%～20%。其高死亡率的主要原因是大部分肺癌患者在发现时已属晚期,病情进展迅速,此时根治性治疗已经无效,错失治疗机会。显然,早期诊断尤其对肺癌至关重要。目前,用于肺癌诊断的检查手段主要有胸部X线片、计算机断层扫描(computed tomography, CT)和肺活检等。另外,当CT检查、正电子发射体层扫描(positron emission tomography, PET)、骨扫描或者脑部核磁共振显像(magnetic resonance imaging, MRI)等影像学技术发现肺癌转移时,纵膈镜检查可用于对邻近淋巴结进行细胞学检查。尽管目前在肺癌诊断和治疗策略方面有很大进展,肺癌患者的预后仍然很差,而根本原因上是由于缺乏早期诊断。本研究使用4200型Z-nose,即电子鼻(electronicnose),对人体呼出气体进行检测并分析,这种由美国EST公司(Electronic Sensor Technology,1077 Business Center Circle, Newbury　Park)研发的快速气相色谱分析仪可在几秒内完成对化学物质的痕量检测,与只是检测若干个选择性化合物的其他检测方法不同,电子鼻能够根据气味识别混合物所含有的完整化学成分。本研究旨在运用4200型Z-nose检测肺癌患者与健康人群呼出气体中含有的多种化学成分,并相互比较从而确定呼出气体中的与肺癌相关的可挥发性有机物(volatile organic compounds, VOCs)作为肺癌诊断的生物标记物,同时结合年龄因素建立用于肺癌诊断的统计学模型。目的使用4200型Z-nose检测比较已病理确诊的肺癌患者和健康人的呼出气体中的VOCs成分,寻找两群体人体呼出气体中VOCs成分的差异,作为肺癌的特异性生物标记物。并结合考虑个体年龄因素等基本情况,来建立一种无创、快速、灵敏、便捷、廉价的早期筛查肺癌的检测方法。方法(1)研究对象及其分组：将暨南大学第一附属医院肿瘤科(广东省广州市)63例已病理确诊的肺癌住院患者纳入试验组研究对象,将广州市及周边地区健康居民(均无肺癌,且无糖尿病、慢性肾功能不全、上呼吸道感染等慢性疾病)72例纳入为健康对照组研究对象,对照组主要来源为试验组肺癌患者家属、暨南大学第一附属医院医务人员以及南方医科大学部分教职工及其家属。同时,收集所有研究对象的年龄、性别、吸烟情况等基本信息,肺癌试验组还需收集病例资料(包括肺癌病理分型、临床分期、转移部位等)。所有研究对象在选取时性别与吸烟情况的按一定比例收集,年龄不作为考虑因素而随机抽取。(2)气体样品采集：采用体积为1升、材质为得维克(Devex)膜的气体收集袋,收集上述135例研究对象的呼出气体。所有研究对象采样前晚至次日采样前均已禁食任何有强烈气味和辛辣刺激的食物(例如辣椒、酒、咖啡、浓茶、大蒜、韭菜、洋葱等),晨起后至采样前无需刷牙并禁食,再进行呼出气体的收集。(3)气体样品检测所用相关试剂的配制：仪器校准所用标准液(C6-C14正构烷烃溶液)由己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷和十四烷9种有机溶液混合,再加甲醇稀释配制而成；配制仪器定量所用标准液(C6-C20正构烷烃标准液)由己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十六烷、十八烷和二十烷12种有机溶液混合而成。(4)气体样品检测基本步骤：运用4200型Z-nose对所有气体样品中的VOCs成分进行定性定量分析。仪器开机并完成所有条件设置之后,首先用C6-C14正构烷烃溶液完成对色谱图横坐标的保留指数[又名科瓦茨指数(kovats index,KI)]校准,再对各气体样品进行检测,最后用C6-C20正构烷烃标准液完成对所有检测结果的色谱图的峰下面积定量校准。(5)特异性VOCs分子筛选：分析4200型Z-nose对试验组和对照组135例气体样品的检测结果,根据保留指数确定每个VOCs成分的具体名称,分析整理检测所得所有VOCs成分种类,总结得出肺癌患者和健康人均具有的VOCs分子种类列表。(6)对检测数据的统计分析：选用R3.0.3与IBM SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。其中两组之间基线资料的比较采用两独立样本t检验和χ2卡方检验；经筛选所得各VOCs成分的含量的组间比较行Mann-Whitney U检验,同时采用二变量logistic回归模型确定其影响程度；采用逐步法对基线资料(性别、年龄、吸烟情况)及Mann-Whitney U检验得出有统计学意义的VOCs成分作变量筛选,得出预报模型；分别以逐步logistic回归得到的预报模型产生各个个体预测概率及有显著意义的变量分别作为检验变量,分组变量为因变量,建立受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC曲线),得出各检验变量的曲线面积,评价回归模型预报能力。统计检验采用双侧检验,取a=0.05为统计检验水准。结果(1)肺癌组与健康组年龄差异有统计学意义(t=6.022,P<0.001),平均年龄分别为59.34±14.35、46.38±9.72岁；而两组男女性别(χ2=0.825,P=0.364)与吸烟情况(χ2=1.289,P=0.258)的差异无统计学意义。(2)由于存在一定的VOCs种类的个体差异,需将135例气体样品的检测结果中出现的所有VOCs成分种类进行分析,总结得出肺癌患者和健康人均具有VOCs成分共23种,分别是二甲基甲烷、乙醇、甲烷、异戊二烯、已烷、甲基环戊烷、苯、庚烷、2-甲基庚烷、辛烷、3-甲基辛烷、二甲基苯、3-甲基壬烷、苯乙烯、2.2.4.6.6-五甲基庚烷、柠檬烯、篙属酮、侧柏醇、十二烷、十三烷、十四烷、苯丙基丁酸酯和1.2.6-三甲基萘。(3)运用Mann-Whitney U检验分析不同组别中23种VOCs成分的含量差异,统计结果显示二甲基甲烷、乙醇、甲烷、己烷、2.2.4.6.6-五甲基庚烷、篙属酮、侧柏醇、十二烷和1.2.6-三甲基萘9种VOCs成分在肺癌患者和健康人群中的分布有统计学差异。(4)运用逐步logistic回归对两组间有差异的9种VOCs成分(二甲基甲烷、乙醇、甲烷、己烷、2.2.4.6.6-五甲基庚烷、篙属酮、侧柏醇、十二烷、1.2.6-三甲基萘)和研究对象个体基本信息(性别、年龄、吸烟情况)进行分析,得到的预测模型为P=1/[1+e(-9.006+0.101*X1+0.01*X2+0.02*X3-0.518*X4)](其中X1、X2、X3、X4分别为年龄、己烷、2.2.4.6.6-五甲基庚烷、1.2.6-三甲基萘)。其中,年龄、己烷、2.2.4.6.6-五甲基庚烷为危险因素,而1.2.6-三甲基萘为保护因素。采用该模型对研究个体进行预测时,当P<0.55,可初步确定该个体为疑似肺癌；若P>0.55,则该个体初步确定为健康人。此预报模型的判对率为82.2%,灵敏度和特异度分别为75%、84%。(5)根据ROC曲线评价回归模型P=1/[1+e(-9.006+0.101*X1+0.01*X2+0.02*X3-0.518*X4)]的预报能力,得出年龄、己烷、2.2.4.6.6-五甲基庚烷和1.2.6-三甲基萘预测概率的曲线下面积(area under the curve, AUC)有显著性意义(P<0.05),且高于单个VOC的AUC,即诊断能力优于单个VOC。预报模型产生的各个个体预测概率的AUC为0.844,灵敏度、特异度为0.75、0.87,截断点为0.60。结论(1)肺癌患者呼出气体中的二甲基甲烷、乙醇、甲烷、己烷、2.2.4.6.6-五甲基庚烷、篙属酮、侧柏醇、十二烷和1.2.6-三甲基萘9种VOCs成分可作为潜在的肺癌特异性生物标记物而用于肺癌的早期筛查与诊断。(2)根据预测模型P=1/[1+e(-9.006+0.101*X1+0.01*X2+0.02*x3-0.518*x4)]分析己烷、2.2.4.6.6-五甲基庚烷和1.2.6-三甲基萘在人体呼出气体中的含量,并结合年龄因素,可以更加有效地早期诊断肺癌。