原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，九十年代以来已成为我国第二位癌症杀手。我国绝大多数肝癌是肝细胞癌(HCC)，手术切除仍是其最主要的治疗方法，但HCC术后的长期生存尚不能令人满意。术后预后的准确评估，可以使一部分病人得到及时的辅助治疗，从而延长术后生存。目前常用的预后预测标记包括肿瘤分期和组织病理学指标。其中组织病理学指标往往不能提供足够的预后信息，而肿瘤分期，如TNM分期，虽是目前最有用的肿瘤预后标记，但对肿瘤术后复发的预测尚显不足，并存在内在的缺陷，如一些处于同一分期的HCC病人，虽经相同的治疗措施但预后却有很大差异，这就需要从分子水平上认识肿瘤发生发展的机制，并把分子生物学的研究成果结合到传统的肿瘤分期中，形成肿瘤的分子分期，从而对肿瘤的预后作出更精确的预测。 众所周知，遗传学改变的积累在恶性肿瘤的发展、侵袭过程中起着重要的作用，如癌基因突变、抑癌基因甲基化、微卫星变异等。其中微卫星变异，主要包括杂合性缺失(LOH)和微卫星不稳定(MSI)，是基因组不稳定的重要标志，成为近年来研究的热点之一，研究表明二者可作为肿瘤预后的预测标记，在肿瘤的分子分期、分子分型中起着重要的作用。另外，越来越多的研究表明，恶性肿瘤患者外周血循环DNA具有肿瘤DNA的特征性改变，并且外周血指标的检测简便易行，临床实用性强，因此人们逐渐倾向于检测外周血肿瘤遗传学标记来预测病人的预后。因此在本课题研究的两部分中，我们分别取HCC肿瘤组织和患者血浆循环DNA标本检测LOH、MSI，探讨二者在HCC分子分期及预后预测中的价值。 第一部分 应用组织显微切割技术对染色体微卫星变异在肝细胞癌分子分期中的价值研究 目的：通过对染色体微卫星变异在HCC根治性切除术后的生存分析，探讨微卫星变异在HCC分子分期中的价值。 方法：我们选取8p、1p、17p、3p、9p、4q、13q及16q共8条染色体上28个具有高度多态性的微卫星标记(上述位点已知含有肿瘤抑制基因或与肿瘤预后相关)，对225例HCC石蜡标本应用组织显微切割技术，获取纯净肿瘤DNA进行微卫星变异检测，并探讨微卫星变异与患者根治术后的5年总体生存(OS)、无瘤生存(DFS)的关系。 结果：杂合性缺失(LOH)在检测的染色体位点上发生明显，而微卫星不稳定(MSI)较少发生。D8S298位点LOH与肝内转移(包括子灶及癌栓)、TNM分期密切相关(P=0.01；P=0.003)。在生存的单因素分析中，D8S298位点LOH的病人根治术后5年OS、DFS率皆明显低于无LOH的病人(39±6 vs 54±5，P=0.024；36±7 Vs 60±6，P=0.002)。即使在TNM I期病人中，LOH者同无LOH者相比，也有着更差的5年OS、DFS(44±9 vs 68±6，P=0.007；42±9 vs 66±6，P=0.038)。同样，在D1S199基因位点，LOH者术后5年OS、DFS率亦显著低于无LOH者(28±7 vs 55±5，P=0.003；29±8 vs 53±5，P=0.02)，特别是在TNM I期病人中，LOH者与无LOH者两组病人的5年OS、DFS也有统计学差别(30±8 vs 69±6，P＜0.001；39±9 vs 66±6，P=0.015)。而在其它分期病人中，D8S298、D1S199位点有无LOH其生存率无统计学差别。在其它26个检测位点，未发现LOH与HCC术后生存相关。在多因素分析中，Cox比例风险模型显示D8S298、D1S199位点LOH分别是HCC病人根治术后DFS、OS较差的独立因素(P=0.039；P=0.016)。 结论：D8S298、D1S199位点LOH是HCC病人根治术后预后较差的独立危险因素，特别是在TNM I期病人中，D8S298、D1S199位点有无LOH其预后明显不同，在HCC病人的分子分期中具有重大的价值。 第二部分 肝细胞癌患者血浆循环DNA杂合性缺失的预后价值研究 目的：探讨肝细胞癌(HCC)患者血浆循环DNA杂合性缺失(LOH)与肿瘤组织的一致性及其在预后中的潜在价值。 方法：在第一部分组织标本的研究中，我们发现D8S298、D1S199两个位点LOH与HCC预后相关，因此在该部分中，我们试探索HCC患者血浆循环DNA在上述两个位点的LOH有无预后价值。但由于该部分收集的血浆标本术后时间较短，仅一年有余，生存分析其预后价值不大，因此我们在该部分中收集126例HCC患者血浆DNA标本进行D8S298、D1S199位点LOH检测，并与临床病理特征相联系，从而通过LOH的临床病理联系探讨其潜在的预后价值。另外选择位于染色体8p上3个具有高度多态性的微卫星标记(D8S277、D8S298、D8S1771)，对其中62例配对的HCC血浆、组织标本进行LOH的一致性检测。 结果：在配对的62例标本中，在联合检测的3个微卫星位点上，39例发生了LOH的组织标本其对应的血浆标本中有33例在相应位点检测到了相同的改变，一致性为84.6％。在126例HCC血浆循环DNA标本中，D8S298、D1S199位点的LOH频率分别为42.0％(37／88)和29.2％(26／89)，并且D8S298位点的LOH与肝内转移、TNM分期密切相关(P=0.028；P=0.050)。而D1S199位点LOH与任一病理特征均无明显相关(P均＞0.05)。 结论：HCC血浆循环DNA与肿瘤组织LOH的检测具有较高的一致性变化。血浆循环DNA在D8S298位点的LOH有可能成为HCC患者术后转移复发潜在的预测标记，在术后的预后预测中发挥重要的作用。