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背景microRNAs(miRNAs)是广泛存在于动物和植物体内,含有大约21～25个核苷酸大小的非编码单链小分子RNAs,它们参与转录后的基因调控。miRNAs可特异性的识别靶mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)并与之结合,引起靶mRNA的降解或翻译抑制,从而对靶基因进行转录后表达调控,进而调节许多重要的细胞活动。miRNAs在人类许多肿瘤细胞中表达异常,大量研究证明miRNAs在肿瘤的发生、发展中起着癌基因或抑癌基因的作用。研究表明,miR-21在大多数肿瘤中异常表达,它主要起着癌基因的作用,miR-21通过对靶基因的调控,调节细胞的分化、增殖和凋亡,参与肿瘤细胞的侵袭、浸润和转移。目的构建miR-21的真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-21,用脂质体Lipofectamine 2000TM转染重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-21,使其在骨肉瘤细胞MG63中稳定高表达,G418筛选4周后获得miR-21稳定高表达的细胞系,这为进一步研究miR-21在骨肉瘤细胞MG63的增殖、转移、凋亡中的作用及其基因调控机制打下基础。方法(1)提取骨肉瘤细胞MG63基因组DNA,从GenBank中搜索得到成熟hsa-miR-21的序列及其前体序列pre- hsa-miR-21,通过人类基因组BLAST数据库找到pre-hsa-miR-21的定位,并且向其两端侧翼序列延伸得到一段约200bp的序列,然后根据该段序列设计PCR引物,并在引物上引入末端的保护碱基、BamHⅠ、EcoRⅠ的酶切位点以及PolyT。同时合成pcDNA3.1(+)的通用引物T7、BGH。PCR扩增退火后用T4连接酶联接到线性化的pcDNA3.1(+)质粒中。并对重组质粒进行双酶切、菌落PCR及测序分析进行鉴定。(2)鉴定完全正确的重组质粒pcDNA3.1(+) -miR-21经脂质体Lipofectamine 2000TM转染骨肉瘤细胞MG63,以G418 (400μg/ml)筛选4周获得稳定高表达miR-21的细胞系,通过Northern blot及实时定量PCR鉴定转染重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-21后,miR-21在骨肉瘤细胞MG63中的表达变化。(3)通过免疫组化、Western blot、流式细胞仪、TUNEL试剂盒检测转染重组质粒后细胞的生物学变化。结果(1)成功构建了miR-21的真核表达载体,经双酶切、菌落PCR及测序分析鉴定:约433bp包含miR-21的DNA片段成功插入到质粒pcDNA3.1(+)中。(2)经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞系,经Northern blot及实时定量PCR鉴定miR-21的表达水平与正常骨肉瘤细胞MG63相比明显升高(P<0.05)。(3)转染重组质粒后,骨肉瘤细胞的生物学特征发生一系列变化,免疫组化显示筛选后获得的细胞(实验组)的细胞膜呈棕褐色;Western blot显示实验组细胞PDCD4表达降低;流式细胞仪检测显示实验组细胞生长周期发生变化。结论(1)成功构建了miR-21的真核表达载体pcDNA3.1(+) - miR-21。(2)转染pcDNA3.1(+) -miR-21后,miR-21在骨肉瘤细胞MG63中稳定高表达。这为进一步研究miR-21在骨肉瘤MG63中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。(3)实验组骨肉瘤细胞MG63的生物学特征发生一系列变化,提示miR-21在骨肉瘤的发生发展中扮演者重要角色。