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豆豉是大豆经微生物发酵而成的一种药食兼用的调味品,它不仅可以烹饪调味,还具有较高的尿激酶活性保健功能。前期研究发现豆豉中含有生物胺(Biogenic Amine,BA),其中纯种强化发酵豆豉中含量最高的BA为酪胺和苯乙胺,含量分别为63.25 mg/kg、13.82 mg/kg;自然发酵豆豉中最多的BA为酪胺和亚精胺,含量分别为27.94 mg/kg、11.50 mg/kg。当食物中酪胺含量超过100mg时会引发偏头痛、高血压等症状,因此豆豉发酵产品中酪胺存在潜在安全性。目前认为降低食品中BA最有效的方法是提高发酵微生物的胺氧化酶(Amine oxidase,AMO)活性,从而分解生物胺。AMO分为单胺氧化酶(Monoamine oxidase,MAO)和多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO),鉴于豆豉中单胺含量最多,所以对MAO酶活性及其发酵生产的影响因素进行研究,提高MAO酶活性,对提高豆类发酵食品安全性具有现实意义。提取专利菌株——枯草芽孢杆菌BJ3-2(Bacillus.subtilis BJ3-2),分别从BJ3-2强化发酵豆豉和自然发酵豆豉中提取AMO粗酶液,检测其活性的动态变化。结果显示,在纯种强化发酵条件下,AMO活性最高是在前发酵42 h和后发酵第7 d,分别为4.74 U/mg和2.73 U/mg;自然发酵条件下则是前发酵36 h和第3 d时酶活性最高,分别为2.39 U/mg和1.76 U/mg。将重组质粒pET28a-YobN转入大肠杆菌BL21,1%重组菌pET28a-YobN/BL21于1000 mL含Kan的LB液体培养基中,180 r/min,16℃过夜培养,1.0 mM IPTG诱导蛋白表达,超声破碎裂解30 min(工作5s、间歇5s),获得融合蛋白,经15%SDS-PAGE电泳检测。结果显示,53.4 kDa处出现特异性带,与预期分子量大小相符。大量诱导蛋白表达,结果显示大部分蛋白以包涵体形式表达。对包涵体部分进行His镍柱纯化(咪唑洗脱浓度为300 mM),使用磁力搅拌器对蛋白样品进行搅拌透析,温度为4℃,每2 h换1次透析液(20 mmol/L Tris-HCl,pH=8.0),换液6次,收集透析袋中的蛋白。采用BCA法测其浓度为1.63 mg/m L,说明所得MAO浓度较高,应用ELISA法测MAO活性为4.8×106 U/g。通过调整MAO的最适温度、pH以及辅料添加量研究酶活变化,确定最适酶活条件为:温度为40℃、pH为8、食盐浓度为4.0%、味精浓度为12.5%、辣椒浓度为3%、茶水浓度为35%、生姜浓度为3%及花椒浓度为2%。MAO为碱性酶,而弱酸性有利于延长发酵食品的保质期,因此水豆豉后发酵pH控制在7.0-7.5能有效提高其安全性。味精对胺氧化酶活性几乎没有影响,食盐和花椒对MAO活性有抑制作用,生姜对MAO有一定的促进作用,茶水和辣椒对MAO的影响为低浓度促进、高浓度抑制。生产中食盐、花椒、生姜和茶水的配料应分别控制在5%、2%、3%和35%。研究不仅对豆豉的生物安全性具有积极的指导意义,同时还为其它发酵豆制品的生产加工提供借鉴。