多种致盲性眼病如葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、早产儿视网膜病变等病理生理过程都涉及炎症反应。炎症是一种非特异性的防御反应,不仅各种各样的分子和功能会改变,而且还发生白细胞的募集和粘附。在急性期,白细胞募集可以清除入侵的有害因素,通常导致组织修复。然而,如果炎症持续,白细胞粘附及长期分泌的化学介质会损伤组织。视网膜炎症反应常导致视网膜组织水肿、出血和渗出,可引起视力不同程度的下降。研究发现主要集中在突触等神经组织、可迅速水解神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)可作为系统炎症的标记物,其基因可以启动DNA结合位点,可能在募集核转录因子(Nuclear Factor-Kappa B,NF-кВ)过程中参与炎症反应,在机体多种器官、组织、细胞的炎症反应中呈现高表达;即使在脑脊液、血浆、组织中的其他炎性标志物升高不明显的炎症反应中,AChE的表达也会明显增加;且多个研究表明,AChE抑制剂在细胞水平和分子水平都有抗炎的功能,可抑制淋巴细胞增殖、促炎细胞因子的产生以及细胞外的酯酶的活动。本课题研究目的是明确AChE在视网膜炎症中的作用及抑制AChE对视网膜炎症的影响,并探讨其中可能机制。实验使用ARPE-19细胞系、AChE基因敲除小鼠及给予AChE抑制剂灌胃C57BL/6J小鼠,研究AChE基因及蛋白水平的变化对视网膜炎症的影响,并且重点分析了这种影响与经典NF-кВ通路的关系。研究发现AChE作为主要分布于神经组织的水解酶,参与视网膜炎症反应,抑制AChE可以减轻视网膜炎症对视网膜炎症有保护作用,并且这种作用可能是通过经典抑制NF-кВ经典通路实现的,这将有利于我们寻找干预和治疗视网膜炎症的新靶点。第一部分抑制AChE对视网膜炎症的影响目的:探讨抑制AChE对视网膜炎症的影响。方法:(1)细胞实验:体外培养人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19),使用AChE抑制剂(多奈哌齐)及AChE si RNA抑制AChE的表达后,利用TNF-α诱导细胞炎症(4小时及24小时),采用细胞爬片免疫荧光及蛋白免疫印迹技术测定AChE及ICAM-1的表达情况;(2)动物实验:○1取2月龄健康雌性C57BL/6J小鼠利用多奈哌齐10mg/kg或相同剂量1XPBS连续灌胃3天后1只眼给予玻璃体腔注射TNF-α1μl(50ng/ml)诱导动物视网膜炎症,另一只眼均给予1XPBS 1μl,将视网膜分为Vehicle组、Vehicle+TNF-α组、Donepezil组及Donepezil+TNF-α组,24h后处死小鼠,检测指标同模型1。○2取2月龄健康雌性AChE+/-和AChE+/+小鼠1只眼均给予玻璃体腔注射TNF-α1μl(50ng/ml)诱导动物视网膜炎症,另一只眼均给予1XPBS 1μl,将视网膜分为AChE+/+组、AChE+/++TNF-α组、AChE+/-组、AChE+/-+TNF-α组,24h后处死小鼠,取小鼠视网膜或视杯,利用蛋白免疫印迹及免疫荧光技术和白细胞粘附实验,检测相关炎症指标的表达;结果:(1)细胞实验:在TNF-α诱导细胞炎症中,AChE、ICAM-1的表达上调,当使用多奈哌齐或AChE si RNA抑制AChE的表达后,AChE、ICAM-1的表达下调且呈最适浓度为10μM;(2)动物实验:给予TNF-α玻璃体腔注射后,AChE+/-+TNF-α组AChE、ICAM-1、Albumin、CD11b的表达及白细胞粘附较AChE+/++TNF-α组低、而C57BL/6J小鼠模型以上指标,Donepezil+TNF-α组较Vehicle+TNF-α组低。结论:抑制AChE对视网膜炎症有保护作用。第二部分抑制AChE对视网膜炎症保护作用的机制研究目的:探讨抑制AChE对视网膜炎症保护作用的机制。方法:(1)细胞实验:体外培养人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19),使用AChE抑制剂(多奈哌齐)及AChE si RNA抑制AChE的表达后,利用TNF-α诱导细胞炎症(5分钟及30分钟),采用细胞爬片免疫荧光及蛋白免疫印迹技术及测定NF-кВ经典通路相关抗体的表达情况;(2)动物实验:方法同第一部分,采用免疫荧光技术检测NF-кВ表达。结果:(1)细胞实验:细胞爬片免疫荧光结果显示,给予TNF-α诱导细胞炎症30分钟时,NF-кВ入核表达增高,当使用多奈哌齐或AChE si RNA后,NF-кВ入核表达降低;蛋白免疫印迹技术结果显示,给予TNF-α诱导细胞炎症5分钟及30分钟时,p-NF-кВ、p-IKK、p-IкВα的表达上调,当使用多奈哌齐或AChE si RNA抑制AChE表达后,以上指标表达下调且最适剂量为10μM;(2)动物实验:TNF-α玻璃体腔注射后,AChE+/-+TNF-α组NF-кВ的入核量较AChE+/++TNF-α组少、而C57BL/6J小鼠模型中,Donepezil+TNF-α组NF-кВ的表达较Vehicle+TNF-α组少。结论:抑制AChE对视网膜炎症的保护作用可能通过抑制NF-кВ经典信号通路实现。