阿维菌素是一类大环内酯类抗生素,具有高效、广谱、低毒的杀虫效果。在农业、医药行业和畜牧业中具有广阔的应用前景。阿维菌素的发酵产物中含有8种组分,分别为Ala, A2a, Bla, B2a, Alb, A2b, Blb和B2b,其中Bla为最有效组分,如何提高阿维菌素产量以及得到阿维菌素单一组分,成为研究热点。传统方法是经过不断的诱变、筛选,虽会使阿维菌素产量得到一定的提高,也可能得到阿维菌素的单一组分突变株,但是盲目性较大,且机制不清楚。本论文采用代谢工程的研究手段,结合合成生物学的方法,研究前体代谢对阿维菌素产量以及a、b组分比例的影响。具体研究内容如下。第一部分：设计了前体添加实验,研究外源添加前体物质是否会使阿维菌素产量提高。向阿维菌素工业生产菌株阿维链霉菌DJ的正常发酵液中添加不同浓度梯度的异亮氨酸和丙酸钠,发酵10天后,HPLC检测阿维菌素产量。实验结果是对照组中的阿维菌素产量高于实验组,外源添加前体物质并没有提高阿维链霉菌DJ产生阿维菌素的产量。第二部分：构建了前体代谢相关基因tdh、ilvBl、ilvB3、ilvB4和ilvH的敲除载体,阿维链霉菌野生型WT、高产型9-39和DJ进行基因敲除。基因ilvBl和ilvH在这三株菌中均无法敲除,可能是必需基因。tdh基因的敲除使9-39产量提高最为明显,达到75%,其次是WT,为44%,对DJ产量略有提高,并不明显,说明截断支流可以促进前体物质异亮氨酸和缬氨酸的生物合成,从而提高阿维菌素产量；基因ilvB3在9-39中无法敲除,对9-39来说,ilvB3可能是必需基因,而在WT和DJ中,均使产量得到了不同程度的提高,WT的提高并不显著,DJ提高了88%；基因ilvB4的敲除对WT和9-39的作用并不明显,而使DJ产量提高了77%左右。分析原因可能是由于阿维链霉菌DJ中这两个基因的敲除导致该菌中阿维菌素合成通路中其他的代谢变化。基因ivB3、ilvB4的敲除对9-39和DJ的阿维菌素组分比例并没有明显变化,可能是由于高产菌株中乙酰乳酸合酶的偏好性主要是受到ilvBl和ilvH的调控,与ilvB3、ilvB4这两个基因的关系并不紧密。在野生型菌株WT中,基因ilvB3、ilvB4的敲除均导致的阿维菌素a组分的降低,说明在WT中这两个基因会参与异亮氨酸和缬氨酸比例的调控,对异亮氨酸的合成有一定的偏好性。第三部分：构建了ilvH基因Asn11→Asp和Asn29→Asp突变的载体,对阿维链霉菌WT、9-39、DJ分别进行定点突变,并构建了不同启动子强度的ilvH过表达载体,对阿维链霉菌WT进行ilvH的过表达。在ilvH基因Asn 11→Asp和Asn29→Asp突变的阿维链霉菌WT、9-39、DJ中,除ilvH基因Asnll→Asp突变的DJ,其他菌株均是阿维菌素b组分的增加,a/b降低,但是Asnll→Asp的作用效果不如Asn29→Asp明显。说明基因ilvH的突变确实会在一定程度上解除缬氨酸的反馈抑制,但对总产量的提高作用不显著。在基因ilvH过表达的阿维链霉菌中,阿维菌素均产生了不同程度的提高,而启动子为gapdhp(RER)时,阿维菌素产量提高最为明显,能达到70%左右。该部分实验为乙酰乳酸合酶的研究提供了参考,为进一步提高阿维菌素产量以及获得a组分的阿维菌素提供了依据。