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番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属,由烟粉虱传播引起番茄黄化曲叶病毒病(TYLCVD),目前该病毒病已在世界范围内多个国家和地区的烟草、番茄等作物上相继发生,给作物的生产造成巨大的损失。为了控制病害的加剧发生,生产中往往采用物理防治、化学防治和生物防治等方法进行防治,不仅成本高,防治效果也不够理想,甚至给环境造成负面影响,因此,抗病品种的培育是最有效的途径之一。本研究利用实验室构建的SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化法共转化番茄,并对获得的转基因材料进行抗病性鉴定,以期获得高抗TYLCV的番茄材料。主要研究进展如下:
1、通过观察番茄外植体在不同浓度卡那霉素分化培养基上的生长状况,确定本研究所用卡那霉素临界筛选浓度为100mg/L。
2、利用SUC2-GroEL植物表达载体(利用拟南芥韧皮部启动子SUC2和烟粉虱内GroEL基因构建)和pBI121-AC1-AC2反向重复序列植物表达载体(利用TYLCV的AC1和AC2基因构建),通过农杆菌介导的遗传转化法共转化番茄,经过卡那霉素筛选,获得19株卡那霉素抗性再生植株。
3、利用PCR技术检测抗性再生植株,初步获得转SUC2-GroEL载体阳性植株8株,转pBI121-AC1-AC2载体阳性植株6株以及转双载体阳性植株3株。
4、利用RT-PCR技术检测阳性抗性再生植株,获得转SUC2-GroEL载体阳性植株5株,转pBI121-AC1-AC2载体阳性植株3株以及转双载体阳性植株2株,说明目的基因在番茄植株转录水平成功表达。
5、对T0代转单/双基因的阳性植株进行农杆菌注射接种和烟粉虱传毒实验,并对植株进行病毒检测和抗病性鉴定,获得抗TYLCV的转SUC2-GroEL载体抗病植株3株,转pBI121-AC1-AC2载体抗病植株3株以及转双载体抗病植株2株。
6、对抗病的T0代阳性抗病植株收种的T1代进行PCR鉴定,获得后代分离的阳性植株。对T1代转单基因和双基因的阳性植株进行农杆菌注射接种和烟粉虱传毒实验,统计转单/双基因植株的发病情况,统计数据表明,这些抗病植株的抗病能力稳定遗传,且转双基因植株的抗病能力比转单基因植株的抗病能力更强。