目的：观察中药复方乳岩宁联合依西美坦对MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠一般状态、自主活动能力及脏器系数的影响，了解中药复方乳岩宁联合依西美坦是否有协同增效的作用；观察中药复方乳岩宁联合依西美坦对MCF-7乳腺癌细胞的病理形态学影响及其凋亡的影响，探讨其诱导细胞凋亡的作用机制；观察中药复方乳岩宁联合依西美坦对MCF-7乳腺癌细胞周期分布、ERα、p-AKT蛋白表达，了解中药复方乳岩宁联合依西美坦抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖的信号转导通路；通过观察中药复方乳岩宁联合依西美坦对MCF-7乳腺癌细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白及p53、Survivin mRNA的表达的影响，了解其抑制乳腺癌细胞增殖的机理及作用机制。材料与方法：1.双侧卵巢切除（去势）模型的制备：10%水合氯醛，100mg/ml，按4ml/kg体质量腹腔注射麻醉，将裸鼠俯卧于手术台上，四肢固定，背部正中（肋弓下缘）处备皮，络合碘消毒，切开皮肤，于脊柱旁开0.5cm，距肋弓下缘0.5cm，依次切开肌肉，剪开腹膜进入腹腔，可见乳白色组织。轻轻将之提出腹腔，即可见被包裹的粉红色米粒大小“桑椹样”卵巢，分离后钳夹、结扎，剪去卵巢，检查有无渗血，分层缝合皮肤，络合碘切口消毒。同样方法切除对侧卵巢，保温20℃左右待麻醉后苏醒。术后肌注青霉素生理盐水（6万U/ml）抗炎，每天注射0.25ml，并用碘伏切口消毒，连续3d。自由摄水和进食，标准SPF饲料，饲养30d，造模成功。2. MCF-7荷瘤裸鼠移植模型的建立:将进入对数生长期的MCF-7细胞用胰酶/EDTA消化后， PBS液清洗2次，加入细胞培养液，直接吹打均匀，0.4%台盼蓝染色，记录活细胞数（＞95%），细胞计数板计数，调节活细胞浓度为1×107/ml，裸鼠右侧胸壁碘伏消毒，使用1ml注射器于2只裸鼠右侧胸壁第二乳垫下接种细胞液0.2ml/只，，接种后10天左右，在接种部位乳垫处出现肿瘤结节，质地较硬，而且逐渐增大，越长越快。当原代肿瘤长至0.8cm3大小时，手术取下肿瘤，使用骨髓穿刺针分别移植至余40只裸小鼠乳垫下：10%水合氯醛（0.02ml/10g体重）腹腔注射麻醉荷瘤裸鼠，无菌条件下取出乳腺癌组织立即放入DMEM培养液中，剪切成1mm3左右的小块,置入骨髓穿刺针中备用。接种前，用碘伏消毒健康裸鼠的右侧胸壁，于右侧胸壁第二乳垫旁开1cm平刺进针，进至乳垫下时插入针芯，将瘤组织留在乳垫下，皮肤消毒，不需要缝合伤口，腹腔一次性注射青霉素1.5万U，裸鼠继续饲养于SPF级箱中。移植后第4-5d后乳垫处即可见肿瘤生长，成瘤率100%，而且形状、大小较整齐，在移植后第15天左右肿瘤可长至9±2mm，经HE染色病理诊断为浸润性导管癌，免疫组化检测ER（+）。3.实验分组及给药：将40只造模成功的裸鼠随机分为4组：①模型对照组②西药组（依西美坦）③乳岩宁组（乳岩宁）④结合组（乳岩宁+依西美坦）根据人和鼠给药剂量换算公式计算各组给药的剂量。①模型对照组：0.2ml只-1.d生理盐水灌胃②西药组（依西美坦）：依西美坦按4mg.kg-1体重给药(相当于临床人用量的10倍)，0.2ml只-1.d-1灌胃③乳岩宁组：乳岩宁为33.3g.kg-1体重(相当于临床人用量的12倍)，0.2ml.只-1.d-1灌胃④结合组（乳岩宁+依西美坦），乳岩宁33.3g.kg-1体重+依西美坦4mg.kg-1体重，0.2ml只-1.d-1灌胃，连续给药21天。4.实验取材实验结束，各组裸鼠分别进行取材，脱颈处死裸鼠置于冰盒上，完整剥离出瘤体，称重后置于冰盒上，肉眼观察瘤组织后，切取肿瘤全层组织，同时多点取材避免肿瘤坏死组织，共取材5份：（1）细胞周期标本：取下一块组织放入2mlPBS液中。（2）电镜标本：将组织切成大小约为1mm3，立即投入0.25%的戊二醛固定液中，置于冰箱中4℃冷藏备用；（3）RT-PCR标本：2-3个大小约8mm3组织块，置于1mlTrizol中，记号笔标记后，立即置于-80℃冰箱中冻存备用；（4）Western Bloting标本：组织块直接置于EP管中，-80℃冰箱中冻存备用；（5）用于HE、TUNEL检测细胞凋亡及免疫组化检测，标本取材后，置于4%多聚甲醛固定液中4℃冷藏备用。5.检测指标：(1)每天观察裸鼠饮食、活动、皮毛色泽、二便及死亡情况，隔日测量绝经后裸鼠体重，绘画体重变化曲线,；分别于用药前、实验第10天、21天用小鼠自主活动测试仪测小鼠5分钟内自主活动次数以判断其活动能力。处死裸鼠摘取肝、肾、脾脏称重并计算脏器指数。脏器指数=脏器重量(mg)/体重(g)。(2)用药21天后脱颈处死裸鼠，完整剥离肿瘤称重，计算抑瘤率，抑瘤率按照公式=(模型组瘤重一实验组瘤重)/模型组瘤重×100%计算；肿瘤组织经4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡与包埋，用石蜡切片机切片，组织切片厚度为5μm，苏木素、伊红染色后光镜观察病理形态学变化；采用TUNNEL法检测肿瘤细胞凋亡率，肿瘤组织，常规石蜡包埋、切片，其余方法步骤按试剂盒说明书进行。细胞核内出现绿色荧光者为阳性细胞，荧光显微镜下观察，每张染色后的切片随机选择5个400×典型的高倍视野，每个视野分别观察100个细胞，共500个细胞，计算出每100个细胞内的阳性细胞平均数作为凋亡指数（Apoptosis Index，AI）。AI=阳性细胞数/计数的细胞个数×100%；进一步以超薄切片术快速冷冻肿瘤组织，采用戊二醛和四氧化锇的双固定法将其固定，脱水、浸透、包埋、切片、透射电镜(TEM)进行超微结构水平上的观测。(3) Annexin V(膜联蛋白V)－PI双染法检测细胞凋亡：乳腺癌组织块置于4℃的磷酸盐缓冲溶液中，机械法剪碎后用0.25%胰酶消化30min－1h，过200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液，调整待测细胞的浓度为5×105-1×106个/ml，取1ml细胞，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，将细胞重悬于200ul Binding Buffer，加入10ul AnnexinV-FITC和5ul PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4℃反应30分钟，加入300ulBinding Buffer后上流式细胞仪检测。结果判定：左上象限：细胞碎片；右上象限：凋亡晚期细胞和死亡细胞；左下象限：活细胞；右下象限：凋亡早期细胞。(4)用药21天后完整剥离出瘤体，称重后置于冰盒上，切开标本取材，置于EP管中，-80℃冰箱中冻存用于Western blot蛋白测定。乳腺癌组织块剪碎后用0.25%胰酶消化30min－1h，过200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液，75％冷乙醇（－20℃预冷）固定细胞12h以上，加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h后上流式细胞仪检测细胞周期；应用Western blot蛋白免疫印迹法检测凋亡调控基因P53、 ERɑ表达，并对结果进行统计分析。(4)RT-PCR的取材是将组织置于1mlTrizol中，标本作好标记后，立即置于-80℃冰箱中冻存备用。采用免疫组织化学法对凋亡调控基因Bcl-2、Bax蛋白的表达进行定性分析； RT-PCR法检测乳腺癌组织中p53、Survivin基因mRNA的表达。结果：(1)体重：各组荷瘤裸鼠体重变化比较：给药前各组裸鼠体质量无显著性差异（P=0.790）。给药后一周除了对照组体重持续上升外，其余各组裸鼠体重出现不同程度下降，乳岩宁组(0.63±0.028)，西药组(0.62±0.019)，结合组下降最少(0.20±0.017)，明显低于乳岩宁组及西药组（P﹤0.05），但是这两组比较无显著差异(P>0.05)；后结合组裸鼠体重也呈缓慢上升趋势，平均体重一直高于乳岩宁组及西药组，直至实验的第15天，体重开始缓慢下降。西药组体重一直高于乳岩宁组，直至实验第19天。第21天实验结束时各组体重：西药组最轻，对照组最重，对照组明显高于西药组、乳岩宁组及结合组（P<0.05），但是后三者之间体重比较无显著差别。除外对照组，各组体重下降比较：西药组(1.61±0.12)，乳岩宁组(1.11±0.0.16)，结合组下降最少(0.93±0.06)，各组间比较有统计学差异（P<0.05）；自主活动次数：实验开始时各组裸鼠自主活动次数均在52次/5分钟（简称52次）左右，各组之间比较无统计学差异（p﹥0.05）。在实验第10天，除外对照组，仪器检测各组裸鼠的自主活动次数下降，西药组组下降最明显，低于其余各组（p <0.01）而乳岩宁组与结合组比较无统计学差异（p﹥0.05），在实验的第21天，仍然保持这种下降趋势，由于肿瘤负荷的增加，各组裸鼠的自主活动次数均呈下降趋势，西药依西美坦组下降明显，低于其余各组（p <0.01），即西药组和结合组均施加了依西美坦的因素，可能与依西美坦能够影响荷瘤裸鼠的消化道不良反应而导致体力下降有关，而乳岩宁方能够对这种损伤有修复的作用。各组裸鼠肝、肾、脾脏器指数变化情况：结果显示结合组肝、肾脏器指数最高，都高于对照组，但无显著性差异(p＞0.05)。西药组的肝、肾、脾的脏器指数都高于乳岩宁组，其中肝、脾的脏器指数与乳岩宁组对比有统计学差异（p﹤0.05）。乳岩宁组的肝、肾、脾的脏器指数与结合组比较均有有统计学差异（p﹤0.05）；瘤重：西药组、乳岩宁组、结合组的肿瘤重量均低于对照组，与对照组比较有非常显著差异（p=0.000﹤0.01），其中结合组的瘤重最轻，明显低于单独用药组（p﹤0.01），西药组的瘤重组低于乳岩宁组，有统计学差异（p=0.041﹤0.05）。西药组、乳岩宁组、结合组的抑瘤率分别为34.2%、25.2%、46.3%，说明乳岩宁方对乳腺肿瘤的生长有抑制作用，并与西药依西美坦有协同作用。(2)病理形态学观察：肉眼观察剥离的移植瘤呈圆形、椭圆形或分叶状，肿块质地中等，剖面为苍白色、半透明、质实的实性区，肿瘤大者中心呈灰白色、有坏死现象。HE染色后光镜观察：肿瘤细胞排列成索状或者簇状，间质少，在肿瘤细胞团中可见伴有中央腔隙的小管结构，病理提示为浸润性导管癌生长旺盛，核大，核仁清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相明显，可见散在坏死灶。对照组可见肿瘤细胞密集，排列紊乱，呈团索样结构，肿瘤细胞大，胞质丰富，核大深染，核浆比例失调，病理性核分裂象广泛存在，异型性明显，可见境界清楚的癌巢；而各用药组肿瘤细胞略增大，可见瘤组织结构破坏，大量出血及坏死细胞，异型细胞明显减少，部分细胞固缩成为孤立的细胞，还可见纤维组织。坏死的肿瘤细胞周围有大量的淋巴细胞和白细胞浸润，显示出肿瘤细胞的生长受到抑制。电镜下观察：对照组：乳腺癌细胞生长代谢旺盛，核浆比例失调，核膜完整，可见双层核膜，胞质内大量线粒体，散在核糖体，细胞器完整；西药组：可见大量坏死细胞，细胞膜破裂，胞质内大量空泡，染色质于边积核膜下，线粒体呈髓样改变；乳岩宁组：细胞以凋亡早期为主要改变，细胞体积明显缩小或增大，胞膜可见泡状膨出，核内异染色质增多、边集，浓缩成团块状，分布在核的周边，有的可见不典型的凋亡小体；结合组：出现凋亡中晚期改变，细胞膜破裂，胞质溢出呈空泡样改变，核裂解明显，可见典型的凋亡小体，其由膜包绕，小体内可见核的残片及细胞器。（3）TUNEL结果：细胞核染成绿色者为阳性细胞，即细胞发生凋亡。每张染色后的切片随机选择5个400×典型的高倍视野，每个视野分别观察100个细胞，共500个细胞，计算出每100个细胞内的阳性细胞平均数作为凋亡指数（AI）。细胞凋亡指数（AI）=凋亡细胞/总细胞数×100%。各用药组与对照组相比，其细胞凋亡指数比较有统计学差异(P=0.000<0.01)；其中结合用药组具有最高的细胞凋亡率，西药组次之，与对照组、单独用药组相比差异均有统计学意义(P=0.000<0.01)。Annexin V(膜联蛋白V)－PI双染法检测细胞凋亡：对照组的细胞存活率最高，明显高于各用药组，差异有统计学差异（P<0.05），细胞凋亡率以结合组（39.25±8.34）最高，明显高于西药组及乳岩宁组（P<0.05），西药组的细胞凋亡率（31.21±7.53）高于乳岩宁组(26.13±6.76)，相比有显著差异性（P<0.05）。(3)流式细胞仪检测细胞周期结果显示：各用药组G0/G1期细胞的比例增多，S期比例明显减少，与模型对照组比较差异显著（P<0.01），结合组的G0/G1期细胞比例最多，S期细胞比例最少，与单纯用药组比较有统计学差异（P<0.05）。但是乳岩宁组与西药组分别对比G0/G1期、S期的细胞比例均无统计学差异（P﹥0.05）；采用Western blot蛋白免疫印迹法，检测各组裸鼠瘤组织中ERα、p-AKT和管家基因β-actin的表达结果：对照组中ERα及p-AKT蛋白高表达，与三个治疗组相比有显著性差异（p﹤0.01）；三个处理组均可下调ERα及p-AKT蛋白的表达，其中以结合组的作用更为显著，与乳岩宁组、西药组相比较有显著性差异（p﹤0.01）。(4)免疫组化法测定肿瘤组织中Bcl-2、Bax的蛋白表达结果：Bcl-2及Bax蛋白表达定位：主要位于细胞浆中，少数在胞膜。表达阳性的细胞可见黄色、棕黄色的颗粒，尤以核周、胞膜明显，阴性细胞胞浆着色明显减弱，甚至呈阴性。对照组中Bcl-2蛋白存在高表达，Bax低表达，Bcl-2/Bax的比值显著升高，而三个处理组Bcl-2蛋白低表达，Bax蛋白高表达，与对照组相比有显著性差异（p﹤0.01）；西药组、乳岩宁组和结合组，都可不同程度的降低Bcl-2蛋白的表达，提高Bax的表达，并使Bcl-2/Bax的比值降低，其中结合组的作用更为显著，与西药组及乳岩宁组相比较有显著性差异（p﹤0.01）。说明模型对照组中存在乳腺癌细胞凋亡过程受阻，生长迅速，失去控制。各用药组均可诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡，可能与下调Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，使Bcl-2/Bax的比值降低有关。（5）RT-PCR法检测乳腺癌组织中p53、SurvivinmRNA表达的结果：各用药组都可不同程度的降低p53、Survivin基因mRNA的表达，明显低于模型对照组（p﹤0.05）；其中以结合组的作用最为显著，与单独用药组相比较有显著性差异（p﹤0.01）。结论:1.中药乳岩宁能改善荷瘤裸鼠一般状态，减轻依西美坦带来的裸鼠体重下降，改善裸鼠活动能力。2.中药乳岩宁联合依西美坦具有抑制乳腺癌生长的作用，可能与阻滞细胞周期进程及调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达来诱导细胞凋亡有关。3.中药乳岩宁联合依西美坦下调通过癌组织中p-AKT、ERɑ蛋白的表达来抑制PI3K-AKT信号通路的活性，下调P53、Survivin基因mRNA的表达来抑制乳腺癌细胞增殖的。