论文部分内容阅读
目的: 随着对肺动脉高压这种疾病研究的越来越深入,人们逐渐意识到抑制肺动脉平滑肌细胞的异常增殖及迁移,寻求更加有效的治疗新靶点很有必要。细胞自噬是一个新兴的研究领域,人类目前所知的内容仅仅是自噬的冰山一角,而且很多研究都显示:自噬参与人类的正常发育及疾病的进程,那么自噬是否也参与了肺动脉高压的发生发展,对于发病晚期的平滑肌细胞异常增殖和迁移过程是否也发挥了作用?是保护性的还是损伤性?这些都还未被明确阐述。因此,在我的研究中引入了细胞自噬。对于小分子活性肽apelin,我们实验室的研究比较多,发现其具有降低肺动脉压力和预防肺血管重建的作用,但是这些研究主要集中在动物水平上,本课题利用原代培养的肺动脉平滑肌细胞,探索apelin对低氧性PASMCs增殖和迁移的调控作用及与自噬的关系,为肺动脉高压治疗研究提供新的理论思路与实验依据。 方法: 1、组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscularcells,PASMCs),并采用α-actin免疫细胞化学法鉴定。 2、采用BrdU免疫细胞化学法研究不同低氧时间对PASMCs增殖的影响。根据低氧处理时间不同,将实验分为control组、低氧6h组、低氧12h组、低氧24h组和低氧48h组,共五组。其中control组使用的是二氧化碳(二相)培养箱,设定的环境为:37℃,5%CO2、21%O2;低氧各组使用的是二氧化碳(三相)培养箱,设定的环境为37℃、5%CO2、1%O2。 3、分别采用Transwell小室侵袭实验及流式细胞术研究不同低氧时间对PASMCs迁移和细胞周期的影响。实验分为两组:control组和低氧24h组。 4、分别采用MDC和LC3/DAPI免疫细胞化学法和Western blot法检测不同低氧时间对PASMCs胞浆内自噬空泡堆积、自噬体生成和自噬相关蛋白LC3表达的影响。实验分为四组:control组、低氧6h组、低氧12h组、低氧24h组。 5、采用MDC和LC3/DAPI免疫细胞化学法检测自噬抑制剂3-MA对PASMCs胞浆中自噬空泡堆积和自噬体生成的影响。实验分为:control组、低氧24h组、低氧24h+3-MA组和3-MA组。 6、分别采用BrdU免疫细胞化学法和Transwell小室侵袭实验研究自噬抑制剂3-MA对PASMCs增殖和迁移的影响。实验分组同上一步。 7、用免疫细胞化学法探索不同apelin浓度(0μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L)对低氧24h组及control组PASMCs增殖的影响,并选择合适的apelin实验浓度。 8、分别采用划痕实验、MDC和LC3/DAPI免疫细胞化学法检测apelin(1μmol/L)对细胞迁移及细胞胞浆中自噬空泡堆积和自噬体生成的影响。实验分为control组、低氧24h组、低氧24h+apelin组、apelin组,共四组。 结果: 1、α-actin免疫细胞化学染色结果显示:原代培养的PASMCs细胞纯度高达(97±3)%,可用于细胞实验。 2、用BrdU免疫细胞化学法得出:与control组相比,低氧能够促进PASMCs增殖,并且低氧24小时和48小时增殖水平更为明显(P<0.05)。 3、Transwell小室侵袭实验结果显示:与control组相比,低氧24小时的PASMCs迁移更明显(P<0.05)。流式细胞术分析结果:与control组相比,低氧24小时的PASMCs处于S期的细胞数量明显增多(P<0.05)。 4、应用荧光显微镜观察MDC和LC3/DAPI免疫荧光染色结果表明,与control组相比,低氧处理的PASMCs胞浆中自噬空泡堆积明显增多,自噬标志性蛋白LC3荧光表达明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果表明,与control组相比,低氧促使自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显增加(P<0.05)。 5、应用自噬抑制剂3-MA明显抑制低氧诱导的细胞自噬。应用荧光显微镜观察MDC和LC3/DAPI免疫荧光染色结果表明,与低氧组相比,自噬抑制剂3-MA明显抑制了低氧引起PASMCs中自噬空泡聚集,降低了自噬标志性蛋白LC3荧光表达(P<0.05)。 6、BrdU免疫细胞化学法和划痕法的结果表明,与低氧组相比,3-MA明显抑制了低氧诱导的细胞增殖和迁移(P<0.05)。 7、BrdU免疫细胞化学法结果显示:apelin(1μmol/L)能够明显抑制低氧24h组PASMCs的增殖(P<0.05)。 8、应用apelin(1μmol/L)作用于PASMCs,划痕法的结果表明,apelin明显抑制了低氧诱导的PASMCs迁移(P<0.05)。应用荧光显微镜观察免疫荧光染色结果表明,与低氧组相比,apelin明显抑制了低氧引起PASMCs胞浆中自噬空泡聚集,降低了自噬标志性蛋白LC3荧光表达(P<0.05)。 结论: 1、低氧不仅促进PASMCs的增殖和迁移,还能激活细胞自噬。抑制自噬可以抑制低氧引起的平滑肌细胞增殖,说明自噬在这个过程中发挥的是保护性的作用。 2、外源性apelin可能是通过抑制自噬降低低氧诱导的细胞增殖和迁移的。