目的:为研究增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因在活细胞中作为报告基因和筛选标记的可行性,特构建其真核表达载体pCDNA3.1(+)-EGFP,并将它转染至Hela细胞和大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)中,观察其在这两种细胞中的表达情况。 方法:以BamH Ⅰ和Not Ⅰ双酶切分别从真核表达载体pCDNA3.1(+)和EGFP载体pEGFP-1中切取线性化pCDNA3.1(+)载体和目的EGFP基因片段,然后将两者连接起来,从而获得重组质粒pCDNA3.1(+)-EGFP,并分别以BamH Ⅰ单酶切和BamH Ⅰ、Not Ⅰ双酶切进行鉴定。以脂质体转染试剂Lipofect AMINE2000分别将构建好的重组质粒转染至培养的Hela细胞和大鼠骨髓间充质干细胞中,分别经G418筛选两周和四周后获得EGFP阳性克隆,进行细胞爬片后放置在荧光显微镜下观察。 结果:成功构建了含EGFP基因片段的真核表达载体pCDNA3.1(+)-EGFP,并顺利转染至Hela细胞和大鼠骨髓间充质干细胞中,EGFP阳性克隆在荧光显微镜下均呈绿色。 结论:EGFP基因能以真核表达载体pCDNA3.1(+)-EGFP的形式在Hela细胞和大鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,并发出绿色荧光,而且可以直接利用荧光显微镜对活细胞进行检测,因此EGFP基因是一种良好的活细胞报告基因和筛选标记。