油松营养生长时相转变关键调控因子的功能及作用机制

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针叶林是陆地生态系统的重要组成部分,也是全球人工林的主体。当前,针叶树良种生产与遗传改良主要依靠种子园,生殖发育调控是决定其良种产量及改良进程的核心生物学问题。与营养生长时相转变和年周期生殖相关的关键转录事件和分子调控程序受到环境线索和内源发育信号的系统控制。然而由于针叶树生殖发育特征及遗传背景与被子植物存在显著差异,被子植物中生殖发育调控网络很难为针叶树相关机制研究提供有效参考。本文以广泛分布于中国北方的重要乡土生态、用材与园林绿化树种油松(Pinus tabuliformis Carr.)为研究材料,通过对油松7个不同龄级植株的转录组数据挖掘,鉴定出在油松年龄途径调控时相转变(phase transition)的关键调控模块,深入分析了PtDAL1与油松SOC1-like成员的功能关联,解析了PtDAL1与PtMADS11通过直接相互作用,结合下游PtNLY启动子并调控其表达,将年龄信号在成年组织中精准转化为生殖发育信号,从而启动生殖转变的分子机制,为针叶树生殖转变分子遗传调控网络解析提供了重要突破口。本研究获得的主要结果如下:(1)基于油松7个龄级材料转录组数据,通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选出一个与年龄极显著相关的调控模块。该转录模块包含随年龄增长表达上升的332个和表达下调的161个差异表达基因,表明油松年龄途径调控生殖转变既包含激活机制也包含抑制作用。年龄相关调控模块基因的表达模式将油松样本清晰分成幼年期(1y-5y)和成年期样本(7y-33y),明确了第7年是油松时相转变的关键时期,首次揭示针叶树时相转变是一个在短时间内完成的迅速变化过程。(2)油松年龄途径相关模块中共有33个转录因子在转录因子共表达网络(TFCN)中紧密联接,该转录模块包含多个基因家族成员,表明年龄途径调控生殖转变机制涉及复杂的调控网络。在33个转录因子中11个MADS-box家族成员占了绝大多数,且DAL1和6个油松SOC1-like网络中紧密联接且与年龄相关系数最高,表明其可能在年龄途径调控生殖转变机制中发挥核心调控作用。(3)通过对PtDAL1与油松SOC1-like成员系统的表达模式分析,明确了PtDAL1与PtMADS11表达模式与年龄的显著相关性,并发现PtMADS11仅在成熟个体组织中表达的特异性。通过晚花白皮松突变体中Pb DAL1与Pb SOC1-like同源基因的表达变化,确定了MADS11的转录与生殖潜力的获得密切相关,且在油松不同轮枝层中验证了MADS11与生理成熟和生殖能力的联系,明确了其作为年龄途径调控生殖转变的候选因子。系统验证了PtDAL1与油松SOC1-like的互作关系,揭示了PtDAL1可能通过与PtMADS11直接互作,将上游年龄信号转变为生殖信号,从而启动时相转变。(4)通过异源表达PtDAL1与PtMADS11,在拟南芥中验证了PtDAL1在生殖转变调控和花器官分生组织分化中发挥的重要作用,而35S::PtMADS11转基因植株仅在短日照下表现出明显的早花表型和有限花序,表明PtMADS11在拟南芥中促进开花需要一个在短日照下激活的作用因子。利用拟南芥过表达和突变体遗传材料,验证了PtDAL1与PtMADS11在拟南芥中虽然都发挥促进生殖生长的功能,但两者的作用位点存在差异,且PtMADS11作为油松中的SOC1-like基因,其功能与At SOC1并不冗余。(5)利用数字PCR技术和RNA-seq检测了35S::PtDAL1转基因植株中成花关键基因转录丰度的变化,发现AP1、FT、CO和SPLs等关键成花基因表达均上调,说明PtDAL1在拟南芥成花调控网路中可能在上游节点发挥相关作用。利用酵母单杂交实验发现PtDAL1可能存在自激活调控模式,且PtNLY可能作为其直接调控下游靶基因,其功能与作用机制需进行后续实验研究。而PtMADS11在油松本体中结合位点及其候选下游靶基因仍需进一步深入解析。(6)构建了一种在油松组织中进行本源基因功能鉴定的瞬时转化体系,成功在油松下胚轴和顶梢组织中应用,为针叶树基因功能验证奠定技术基础。利用油松瞬时转化体系,在下胚轴组织中实现PtDAL1和PtMADS11基因的瞬时表达,根据转录组数据分析,进一步筛选出PtDAL1和PtMADS11下游候选响应基因,为其功能的挖掘和调控通路的解析提供了数据支撑。通过GO注释和KEGG富集分析,揭示了PtDAL1和PtMADS11下游响应基因在生殖生长、生长发育、激素响应和光合作用等多个途径中发挥作用。并发现PtDAL1和PtMADS11的下游候选基因在功能注释和通路富集上存在很大的相似性,两者可能在共同的调控网络中协同发挥作用。本研究在针叶树中通过大规模转录组数据分析,探究了油松年龄途径调控生殖转变的遗传调控机制;首次在转录水平上明确针叶树时相转变是一个在短时间内完成的剧烈变化,而非一个平缓持续的过程;解析了油松SOC1-like成员多样化的功能模式,其存在2个功能相斥的亚模块,丰富了目前对SOC1-like成员的认知;建立了一种简单高效的油松组织瞬时转化体系,结合RNA-seq技术筛选了PtDAL1和PtMADS11的下游响应基因,其功能涉及生殖生长、生长发育、激素响应和光合作用等多个途径,为进一步解析PtDAL1和PtMADS11下游调控层次分析提供了数据支撑;分析了PtDAL1通过与PtMADS11相互作用调控生殖转变的作用机制,并在油松中筛选到PtNLY作为其下游靶基因发挥功能,为针叶树生殖发育分子机制解析奠定基础。
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