研究背景：前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PC SK9)自2003年被发现以来,大量研究证实其与动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)形成关系密切。PCSK9与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)结合,介导LDLR在细胞溶酶体降解,减少肝细胞对低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)摄取,从而使血浆中的LDL-C水平升高。PCSK9主要通过调节血浆LDL-C水平参与AS的发生。PCSK9抑制剂通过抑制PCSK9与LDLR结合而达到降脂目的,大量的临床试验结果证实其降低LDL-C水平明显,并且具有良好的安全性及耐受性。PCSK9抑制剂有望成为继他汀后最具发展前景的降脂药,2015年已有两种PCSK9抑制剂通过批准上市。然而,PCSK9促进AS形成的具体机制并不清楚,且关于PCSK9对荷脂细胞胆固醇流出的影响的研究国内外罕见报道。目的：研究PCSK9对THP-1源性荷脂细胞胆固醇流出的影响,并初步探讨类固醇调节因子结合蛋白-2(SREBP-2)蛋白表达在其中的作用。方法：1.建立荷脂细胞模型 体外培养人单核细胞(THP-1)系细胞,用100ng/ml佛波脂(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞。50mg/1氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)孵育巨噬细胞24h。用油红O染色Ox-LDL孵育后的巨噬细胞,观察细胞内脂滴情况。设空白对照组(巨噬细胞组)、实验组(Ox-LDL无血清培养基孵育巨噬细胞24h)。提取蛋白,用BCA试剂盒进行蛋白定量,将提取的蛋白样品上样于高效液相色谱仪,检测细胞内总胆固醇(TC)、胆固醇脂(CE)、游离胆固醇(FC)的含量,建立荷脂细胞模型。2.22-NBD-胆固醇对荷脂细胞的影响22-NBD-胆固醇孵育荷脂细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞对胆固醇摄取情况。不同浓度22-NBD-胆固醇(0.1mg/1, 1mg/1,5mg/l)孵育荷脂细胞,并在(Oh、2h、4h、6h、8h、10h、12h)用多功能酶标仪检测细胞内22-NBD-胆固醇含量。3. PCSK9对荷脂细胞胆固醇流出率的影响：实验设计分为空白对照组(巨噬细胞)、阴性对照组(荷脂细胞)、5个实验组(荷脂细胞+0.01ug/ml、0.05ug/ml、0.1ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml PCSK9),将各组细胞分别用22-NBD-胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)处理后,用多功能酶标仪分别检测培养基和细胞中的22-NBD-胆固醇含量,计算胆固醇流出率。4. PCSK9与Atorvastatin对荷脂细胞胆固醇流出率的影响：实验分为5个组：空白对照组(巨噬细胞组)、阴性对照组(荷脂细胞组)、3个实验组(0. 1ug/ml PCSK9组、0.1ug/ml PCSK9+0.lumol/L Atorvas tatin组、0.1 ug/ml PCSK9+10umol/L Atorvastatin组)。将培养的细胞用22-NBD-胆固醇(5 mmg/L)无血清培养基培养,然后将预先配置好的PCSK9、Atorvastatin加入实验组细胞,再在各组中加入50mg/LHDL的无血清培养基培养。6h后用多功能酶标仪分别检测培养基和细胞中的22-NBD-胆固醇含量,计算胆固醇流出率。5. SREBP-2蛋白的相对表达：实验设计分空白对照组(巨噬细胞)、阴性对照组(荷脂细胞)、实验组(0. lug/ml PCSK9作用于荷脂细胞24h组)。用western blot法检测各组SREBP-2蛋白表达情况。结果：1.用PMA诱导THP-1后分化为巨噬细胞,再用Ox-LDL孵育细胞后,高效液相色谱仪测得CE/TC百分比为36.18±5.11%,大于20%且小于50%,成功建立荷脂细胞模型。2.不同浓度22-NBD-胆固醇处理荷脂细胞后,荷脂细胞摄取胆固醇含量在6h进入平台期,发现5mg/l 22-NBD-胆固醇组细胞摄取胆固醇含量最多(P<0.05)。3.不同浓度PCSK9干预的荷脂细胞胆固醇流出率随浓度的增加而降低,与阴性对照组比较,实验组胆固醇流出率明显降低(P<0.05)；0. lug/ml PCSK9组胆固醇流出率为20.60±2.07%,与其他各实验组比较有统计学意义(P<0.05)。4. PCSK9与Atorvastatin共同干预荷脂细胞,与阴性对照组比较,胆固醇流出率明显降低(P<0.05)；实验组中,0.1ug/ml PCSK9+10umol/L Atorvastatin组胆固醇流出率为10.24±1.44%,与0. 1ug/ml PCSK9组比较,具有统计学意义(P<0.05)。5. PCSK9作用于荷脂细胞后,与空白对照组比较,荷脂细胞内SREBP-2蛋白表达上调(P<0.05)。结论：1.PCSK9能有效抑制THP-1源性荷脂细胞胆固醇流出,PCSK9与Atorvastatin能更有效抑制THP-1源性荷脂细胞胆固醇流出。2. PCSK9抑制胆固醇流出,其作用可能与SREBP-2蛋白表达上调有关。