【摘 要】
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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)cry1Ah1基因由本实验室克隆获得,具有我国自主知识产权,其表达的蛋白对亚洲玉米螟等鳞翅目害虫具有很好的杀虫活性,已用于转基因抗虫作物的研制,并获得具有较好抗虫性状的转基因品种。cry1Ab/c基因是由cry1A(b)和cry1A(c)融合而成的杂合Bt基因,该杂合基因已经成功导入水稻,开发出优良转基因水稻新品种TT51-1。随着转基
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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)cry1Ah1基因由本实验室克隆获得,具有我国自主知识产权,其表达的蛋白对亚洲玉米螟等鳞翅目害虫具有很好的杀虫活性,已用于转基因抗虫作物的研制,并获得具有较好抗虫性状的转基因品种。cry1Ab/c基因是由cry1A(b)和cry1A(c)融合而成的杂合Bt基因,该杂合基因已经成功导入水稻,开发出优良转基因水稻新品种TT51-1。随着转基因技术的迅猛发展,转基因产品的安全性受到了广泛关注。转基因检测用有证标准物质在确保转基因产品定性、定量检测结果的可比性和可追溯性方面发挥着重要作用,但转基因蛋白质标准物质的开发相对滞后,亟需建立其制备体系。本研究针对Bt表达系统制备及纯化Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白,建立标物制备体系,主要结果如下:优化了Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白制备及纯化体系,获得了可用于标准物质制备的纯蛋白。确定Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白的活化条件分别为:蛋白:胰蛋白酶=10:1的质量比、15%的甘油37℃水浴2 h;蛋白:胰蛋白酶=10:1的质量比、37℃水浴2 h。利用离子交换色谱和排阻色谱逐级纯化的方法,获得了高纯度的Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白(排阻色谱纯度分别为:99.66%和99.68%)。之后利用Edman降解法和质谱法确定了Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白活化后的氨基酸序列(分别为50I-622R和24I-615R),明确活化后Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白的氨基酸序列,可以为基于同位素稀释质谱法的蛋白标准物质研制奠定基础。建立了Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白同位素稀释质谱法分析体系,并对候选蛋白标物进行了均匀性检测、稳定性检测和定值。确定两个蛋白完全水解时间分别为24 h和12 h,建立了基于蛋白水解的Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白定值溯源体系。方差分析结果显示这两种蛋白标准物质的均匀性良好;并在常温储存14天、4℃储存28天、-20℃储存8周和-70℃储存6个月的时间段内稳定性表现良好。经过定值和不确定度评估得到Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白标准物质的浓度分别为(38.8±1.4)μg/g和(99.9±3.4)μg/g。本研究建立了Cry1Ah和Cry1Ab/c蛋白标准物质研制体系,制备出符合国家二级标准物质要求的两种蛋白标准物质,有助于转基因蛋白标准物质研制的发展,并为以后转基因蛋白的检测提供可靠、有效的保证。
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