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鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)为多胺合成第一个限速酶,催化鸟氨酸脱羧生成腐胺,腐胺再相继生成精脒和精胺。腐胺、精脒和精胺统称多胺。多胺的代谢与肿瘤的发生和维持肿瘤细胞恶性表型有着密切的关系,鸟氨酸脱羧酶可以通过调节多胺的含量在细胞增殖、分化和肿瘤的发生发展中起重要的作用。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,在我国的死亡率居恶性肿瘤之首。胃癌的致病因素较多,发病机理尚未完全阐明。早期胃癌患者无任何症状或症状缺乏特异性,因此胃癌的早期诊断较为困难,病人就诊往往是晚期,死亡率较高。目前,治疗胃癌首选手术及术后常规化疗,手术后5年生存率只能到40%。胃癌治疗的其他方法正在探索中。国外报道鸟氨酸脱羧酶水平在多种癌组织中增高。但是,鸟氨酸脱羧酶与胃癌的关系未见报道。为了研究ODC基因作为胃癌诊治靶标的可行性,为探讨以ODC为靶标建立胃癌早期诊断和基因治疗方法提供理论依据和技术对策,本文首先从组织水平研究了ODC基因表达与胃癌的关系,继而利用ODC反义RNA表达载体转染细胞株SGC-7901与GES-1,从细胞水平观察ODC基因下调抑制胃癌的作用。第一部分ODC基因在胃癌组织表达水平的研究[实验方法]1.半定量RT-PCR检测标本中ODCmRNA分别取21例新鲜胃癌标本及距肿瘤处7cm外的癌旁组织,所有标本均经病理证实。其中高中分化10例,低分化11例。按照Trizol试剂盒的说明提取结直肠癌组织及正常组织中的总RNA,用随机引物Oligo dT按照试剂盒说明书反转录(RT)合成cDNA第一条链,RT反应产物用作PCR的模板DNA,使用特异性引物进行PCR。β-actin基因作为内参照。取10μl PCR产物在2%琼脂凝胶电泳,紫外灯下观察电泳带,凝胶成像分析系统扫描拍照。分析读取各条带灰度,并将所获得的目的基因与作为内参的管家基因条带灰度进行比较。通过在半定量水平测定21例胃癌患者的癌旁组织和癌组织中的ODC mRNA表达的相对水平,观察其与临床病理学指标的关系。统计学处理:每个样本重复测定3次,实验结果以均数士标准差((?)±s)表示,采用配对t检验和两个样本的t检验、使用SPSS(12.0)软件进行统计学处理。2.Western Blot检测标本中ODC蛋白表达量标本经常规处理后,剪碎,用组织裂解液RIPA制备匀浆,提取总蛋白并测定浓度,经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育及显色得出结果。[实验结果]1.21例胃癌标本中ODC mRNA表达丰度以均数±标准差表示,癌组织1.25±0.34,癌旁正常组织为0.36±0.18,胃癌组织ODC mRNA表达量较癌旁正常粘膜组织显着升高,差异显着(P＜0.01)。低分化胃癌ODC mRNA表达量较高中分化显著升高,差异显著(P＜0.01)。2.Western Blot显示肠癌组织中ODC蛋白表达量明显高于癌旁正常组织。[结论]本文证明胃癌组织中ODC基因表达增高,并且低分化胃癌ODC的基因表达量高于高中分化胃癌,表明胃癌的发生和发展与ODC的表达有关。上述研究结果提示ODC可作为胃癌基因诊断的靶分子,也初步提示ODC基因可作为胃癌基因治疗的靶标。第二部分抑制ODC基因的表达与胃癌细胞株生长、侵袭能力关系的研究[实验方法]1.鸟氨酸脱羧酶pcDNA-ODCr反义载体瞬时转染胃癌细胞株,Western-blot检测转染后细胞株中ODC的表达pcDNA-ODCr载体带有ODC蛋白质编码区的反义序列,采用脂质体包被该反义载体并瞬时转染胃癌细胞株SGC-7901与胃永生化细胞GES-1。同时设计空白pcDNA3.1转染对照组与空白对照组。Western-blot检测转染细胞株中ODC蛋白质的表达量,并与空白pcDNA3.1载体转染组与空白对照组进行比较。2.细胞活性检测法(MTS)检测转染后细胞株的增殖能力用MTS法检测反义载体转染组细胞、空白载体转染组细胞以及空白对照组细胞的增殖活性。检测时刻分别是转染后0h,24h,48h,72h,并绘制细胞的增殖曲线。3.检测转染后癌细胞株的侵袭能力用Transwell小室检测反义载体转染组肿瘤细胞的侵袭能力,并与空白pcDNA3.1组和空白对照组进行比较。[实验结果]1.Western blotting结果显示反义载体转染后,胃癌细胞株ODC蛋白表达量明显降低。2.绘制细胞增殖曲线,反义载体转染胃癌细胞SGC-7901与胃永生化细胞GES-1细胞后,两株细胞的增殖活性均较对照组明显降低,抑制率分别为60%和57%。3.Transwell小室侵袭实验证实鸟氨酸脱羧酶pcDNA-ODCr反义载体可以抑制胃癌细胞SGC-7901和胃永生化细胞GES-1的侵袭能力。[结论]ODC反义载体pcDNA-ODCr可以下调胃癌细胞株中的ODC表达量,转染后的胃癌细胞株增殖与侵袭能力下降,表明ODC基因下调能起到治疗胃癌的作用。总之,以上实验结果证明ODC的基因表达与胃肿瘤的发生与发展有密切关系,抑制ODC的基因表达可以抑制胃肿瘤细胞的生长。提示鸟氨酸脱羧酶基因作为胃癌基因诊断与治疗的靶标是可行的,为胃癌基因诊断与治疗的方法学研究提供了理论依据和技术对策。