细胞外信号TGF-β家族在多种生物的早期胚胎的胚层建立和细胞分化中起重要作用。研究发现它们可能参与了人类胚胎干细胞多能性的维持和分化等调控过程。本论文通过抑制TGF-β家族中的TGF-β/Activin信号通路,诱导人类胚胎干细胞分化,对其在人类胚胎干细胞分化过程中的作用进行了研究。此外我们还初步获得了TGF-β/Activin信号通路下游重要目的基因Nanog条件基因敲除以后,发生同源重组的小鼠胚胎干细胞和C57B/6J成年小鼠不同组织器官中Nanog基因的表达情况,为Nanog条件基因敲除小鼠模型的构建奠定基础。本文在胚胎干细胞和成体组织两个不同的层次上研究了TGF-β/Activin信号对于干细胞多能性的维持和定向分化过程中的调控作用。SB-431542主要是通过抑制TGF-β1 activin receptor-like kinases (ALKs)中的ALK4、ALK5、ALK7来抑制TGF-beta/Activin信号通路的。本论文主要是用分别含0,1,10μM SB-431542的CM(条件性培养液)培养贴壁生长的人类胚胎干细胞系H1细胞4天、6天、8天、10天和12天。收集各个时期的细胞样品,然后应用实时荧光定量PCR技术分析各个胚层和组织器官标志物的表达,以分析人类胚胎干细胞分化的方向;同时检测其它重要信号通路例如FGF,Wnt和BMP等通路中相关基因的表达变化。结果显示TGF-β/Activin信号通路被抑制后,人类胚胎干细胞失去多能性,并高表达GCM-1,CGA和Hand1等滋养外胚层的标志基因,而且随着时间的延长和SB-431542浓度的增加,这些基因的表达具有更加显著的上调趋势。但是中胚层,外胚层和内胚层的标志物表达不显著,这表明抑制TGF-β/Activin信号通路,人类胚胎干细胞特异的向滋养外胚层分化。另外我们还检测了0,10μM SB-431542处理10天后人类胚胎干细胞FGF,Wnt和BMP信号通路相关基因的表达,结果显示FGF2,FGF4,FGF8, BMP7和Wnt3的表达都下调,BMP2和BMP4表达变化不显著。结合本实验室之前的结果,推测TGF-β/Activin信号通路可能诱导FGF2,FGF4,FGF8, BMP7和Wnt3的表达。此外,为了在不同层次上研究TGF-β/Activin信号对于干细胞多能性的维持和定向分化的调控机理,我们还应用分子克隆技术构建将Nanog第二个外显子置换成Loxp-FRT- Neo- FRT-外显子2-Loxp的同源重组载体,通过电转,将线性化的载体转入小鼠胚胎干细胞中进行同源重组,用药物G418筛选出抗G418的携带有Neo基因的小鼠胚胎干细胞系,最后通过PCR初步筛选出同源重组的小鼠胚胎干细胞系。同时我们详细分析了Nanog基因在成年C57B/6J小鼠各个器官的表达。RT-PCR结果显示在成年C57B/6J小鼠中Nanog基因不仅在胚胎干细胞和生殖系统中表达,而且在成年小鼠的小脑,肾脏,肺和大脑表达。本文对TGF-β/Activin信号通路在人胚胎干细胞分化中的影响有了初步的研究,为进一步揭示人类胚胎命运决定的分子机制奠定了基础。同时用人类胚胎干细胞作为一个全新的人类胚胎发育模型来研究人类胚胎发育早期命运决定的机理,这将为人类胚胎的发育生物学研究提供新的模型。Nanog基因同源重组的小鼠胚胎干细胞系的初步获得和组织器官中相关基因的表达情况分析,为条件敲除小鼠模型的建立及其进一步理解成体干细胞自更新以及分化的调控机理打下了坚实的基础。