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L-异亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）是高等动物的8种必需氨基酸之一，在饲料、食品、医药等领域中具有重要的应用价值。L-异亮氨酸的发酵生产主要以亲缘关系相近的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）和乳糖发酵短杆菌（Brevibacteriumlactofermentum）为生产菌株，合成过程中的关键辅酶为NADPH，而NAD激酶是NADPH从头合成的关键酶，也是细胞内唯一一种催化辅酶Ⅰ[NAD(H)]生成辅酶Ⅱ[NADP(H)]的酶。本论文中我们研究了三种棒杆菌NAD激酶的酶学性质，以及它们对L-异亮氨酸生产的影响，主要研究内容和结果如下：从谷氨酸棒杆菌ATCC13032、乳糖发酵短杆菌ATCC13869和L-异亮氨酸合成菌乳糖发酵短杆菌JHI3-156三株棒杆菌中分别扩增出NAD激酶基因ppnK1、ppnK2、ppnK3并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中进行诱导表达。测定了纯化后融合蛋白PpnK1、PpnK2、PpnK3的酶学性质。三种PpnK都是polyP/ATP-NAD激酶，优先以ATP为磷酸供体，以NAD+为磷酸受体。PpnK1的ATP-NAD+激酶酶活（3.25±0.16U/mg）高于PpnK2（0.20±0.03U/mg）和PpnK3（0.95±0.08U/mg）；PpnK2的酶活力和催化效率都比较低，并最易受到NADH、NADP+和NADPH的抑制；PpnK3具有较高的温度和pH稳定性。比对了三种PpnKs的氨基酸序列。与PpnK1相比，PpnK3有两个差异位点（S57P，S117P），PpnK2则有四个差异位点（L35F，S57P，V80L，N223K）。构建了点突变ppnK1表达菌株，纯化得到两个单点突变蛋白PpnK1S57P和PpnK1S117P并测定了它们的酶学性质。第S57P位突变对酶活力的影响较小，而S117P位突变对酶活的影响较大，是导致PpnK3酶活降低的关键差异位点。两个突变蛋白都具有较好的热稳定性和pH稳定性。将ppnK1、ppnK2、ppnK3克隆到大肠杆菌-棒杆菌诱导型穿梭表达载体pDXW-8和组成型穿梭表达载体pDXW-9中，并转入乳糖发酵短杆菌JHI3-156中，构建出ppnK表达菌株——重组乳糖发酵短杆菌JHI3-156/pDXW-8-ppnK1、JHI3-156/pDXW-9-ppnK1、JHI3-156/pDXW-9-ppnK2和JHI3-156/pDXW-9-ppnK3。对重组菌和对照菌JHI3-156/pDXW-8、JHI3-156/pDXW-9、JHI3-156进行了摇瓶发酵。结果表明，诱导型和组成型表达ppnK1基因有利于细胞的生长，促进了胞内辅酶Ⅱ的供应，L-异亮氨酸的产量达到3.86±0.12g/L和2.99±0.18g/L，分别比JHI3-156提高了85.6%和43.8%，比空载对照菌提高了82.9%和41.7%。组成型表达ppnK2能提高细胞内NADP+和NADPH的供应，L-异亮氨酸产量达到2.62±0.16g/L，比JHI3-156/pDXW-9空载菌提高了24.2%；组成型表达ppnK3能促进NADPH和NADP+的供应，L-异亮氨酸产量达到2.89±0.33g/L，比JHI3-156/pDXW-9空载菌提高了37.0%。这些研究结果表明NAD激酶的过量表达能有效地补充细胞内NADPH的供应，提高菌株的L-异亮氨酸合成能力，因此是一种有利的代谢工程手段。