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目的:通过先后天病因病机复合造模法,构建肾阳虚体质动物模型。宏观行为学表征和微观分子生物学指标初步论证肾阳虚体质动物模型构建成功,并通过线粒体相关酶学指标与线粒体重测序法,研究肾阳虚体质与线粒体能量代谢低下的关联。方法:1.亲本筛选:SD大鼠雌性130只,雄性90只,通过寒热板示差法筛选亲代阳虚怕冷大鼠,寒热板得分大于300s,纳入亲代组,交配选育。2.造模方法:阳虚孕鼠低温环境、恐伤肾、盐黄柏灌胃复合造模,正常组孕鼠生理盐水灌胃。造模时间:捡到阴栓后,孕鼠开始造模、正常组正常喂养,直到仔鼠出生为止。3.造模后评价:观察子代鼠初生体重、数量。随机选取雌鼠8只、雄鼠8只、正常组8只,观察一般情况、体重、肛温等,进行旷场实验,观察大鼠扎堆时间、粪便粒数等;ELISA方法检测cAMP、cGMP含量。4.线粒体酶学检测:成模后随机从模型组和正常组选取雄鼠8只,采用ELISA方法检测,线粒体ATP酶、Complex I、ComplexⅢ、ComplexⅤ、Na~+K~+-ATPase含量。5.线粒体重测序检测:随机选取母鼠、模型组、正常组雌鼠各3只,运用DNA重测序技术进行线粒体全基因组测序。结果:1.亲本筛选结果:雌鼠85只,雄鼠41只。2.初生子鼠体重、数量模型组初生幼鼠体重明显低于正常组(P=0.000<0.01),正常组23只,模型组65只(死亡1只)。3.模型评价(1)宏观行为学结果1一般情况:正常组大鼠精神状态良好、活动正常、反应敏捷、目光有神、毛色光亮。模型组大鼠精神状态尚可、反应较迟钝、喜静、舌色偏暗,毛色晦暗、凌乱。2体重和肛温:模型组大鼠体重明显高于正常组(P=0.000<0.01),模型组大鼠的肛温低于正常组(P=0.002<0.05);3模型组较正常组大鼠饮水量降低(P=0.000<0.01);4模型组大鼠大便粒数较正常组大鼠大便粒数少(P=0.02<0.05);5扎堆时间:模型组与正常组雌性大鼠扎堆时间相比,模型组扎堆时间较长(P=0.01<0.05);模型组雄性大鼠的小便量较正常组雄性大鼠的小便量明显增多(P=0.000<0.01)。(2)微观生物学指标与正常组比较:模型组大鼠血清cAMP水平有升高趋势(P=0.177>0.05);血清cGMP水平显著升高(P=0.00<0.01);cAMP/cGMP比值显著性降低(P=0.032<0.01)。4.线粒体能量代谢相关酶学检测结果:模型组ComplexⅠ、Na~+K~+-ATPase明显低于正常组;正常组ComplexⅢ低于模型组。5.线粒体DNA重测序结果SNV结果显示:与参考碱基相比存在99个突变位点,其中错义突变21个,沉默突变72个,其余6个软件未给出突变类型。分别与基因:mt-Rnr1、Trnw、mt-Co1、mt-Co2、mt-Atp6、mt-Nd4相关。结论:1.基于先(恐伤孕鼠)后(寒冷环境)天复合造模法可成功构建肾阳虚体质大鼠模型。2.肾阳虚体质大鼠模型存在线粒体相关酶水平的改变,这与肾阳虚体质人群临床表现畏寒怕冷相一致,初步论证肾阳虚体质存在线粒体能量代谢功能的改变。3.肾阳虚体质动物模型线粒体突变位点的筛查,在一定程度上论证了肾阳虚体质与线粒体位点突变有关,提示肾阳虚体质可能存在与线粒体遗传相关的改变。