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在枯草芽孢杆菌中,HPr蛋白既参与葡萄糖的跨膜运输,也参与碳分解代谢物阻遏作用(CCR).己糖磷酸转移酶系统(PTS)是枯草芽孢杆菌主要的葡萄糖跨膜运输系统,HPr蛋白在15位组氨酸磷酸化,形成HPr-Hisl5-P,作为磷酸基团由磷酸烯醇丙酮酸传递给酶Ⅱa的中间载体.同时,碳分解代谢物激活双功能的HPr激酶/HPr-Ser46-P磷酸酶(HprK/P)的激酶活性,HPr激酶催化HPr蛋白46位的丝氨酸磷酸化,形成HPr-Ser46-P,作为碳分解代谢物调节蛋白(CcpA)的辅助因子,与CcpA蛋白形成复合物,在细胞的CCR效应中,起主要的调控作用.
重组枯草芽孢杆菌24A1是一株CcpA缺陷的核黄素生产菌株.由于CcpA的缺陷,破坏了细胞的碳分解代谢物调控机制,降低了葡萄糖所引起的CCR效应的强度,使核黄素发酵能够在高葡萄糖浓度下进行.但是,高浓度葡萄糖所引起的胞内碳分解代谢物水平的升高,仍然能够激活HPr激酶,使HPr蛋白46位丝氨酸被磷酸化.高浓度葡萄糖的存在使HPr激酶的活性持续存在,必然导致大部分HPr蛋白以HPr-Ser46-P的形式存在.非磷酸化的HPr的缺乏,可能会在一定程度上影响PTS系统的正常功能,降低细胞对葡萄糖的吸收速率.
本文采用插入失活方法敲除了枯草芽孢杆菌24A1的hprK基因,构建了CcpA、HprK/P双缺陷的菌株B.subtilisZHc/pMX45.初步摇瓶发酵显示,B.subtilisZHc/pMX45可以耐受12﹪的葡萄糖,与24A1/pMX45相比,在10﹪葡萄糖浓度下,核黄素积累量提高了19.2﹪,达到4.374mg/mL.