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奶牛小肠对淀粉类能量饲料的消化吸收能力有限,仅有40~62%的小肠淀粉能够被消化。在当前的生产模式下,奶牛通常补饲大量淀粉,用以维持高产期的泌乳性能,这会增加瘤胃酸中毒的风险,同时,过瘤胃部分的淀粉在小肠内得不到充分的消化,会造成动物腹泻和饲料资源的浪费,产生这些现象的主要原因是奶牛胰腺淀粉消化酶类分泌不足。研究发现,功能性氨基酸(亮氨酸和苯丙氨酸)能调控成年反刍动物胰液的外分泌和幼龄反刍动物胰腺的发育,改善小肠淀粉类饲料的消化吸收,提高能量的利用效率和生产性能,并有助于缓解特殊生理阶段高产奶畜的能量供应问题。以信号网络分析为核心,进一步研究亮氨酸和苯丙氨酸调控奶牛胰腺外分泌功能的分子机理,可为精准发挥功能性氨基酸改善奶牛的消化力奠定理论基础。本论文通过体外原代细胞培养试验与组织块孵育试验,采用分光光度法、透射电镜法、实时荧光定量PCR、Western Blot、Elisa、Label-free蛋白质组学分析等方法研究培养基中不同浓度亮氨酸和苯丙氨酸对奶牛胰腺腺泡细胞和组织块的消化酶转录、翻译和分泌过程中的影响,同时检测氨基酸介导的相关信号网络效应分子变化,探究氨基酸调控胰酶合成和分泌的机理。试验一苯丙氨酸调控奶牛胰腺腺泡细胞消化酶合成和分泌的分子机制本试验以新生奶公犊牛胰腺原代腺泡细胞为模型,通过检测苯丙氨酸对原代腺泡细胞消化酶合成和分泌,以及相关mRNA表达和mTOR信号通路因子磷酸化的影响,揭示苯丙氨酸调控奶牛胰腺腺泡细胞消化酶合成和分泌的分子机制。试验设置3个苯丙氨酸浓度梯度,分别为0,0.15和0.45 mM,每处理6重复,培养时间为120 min。结果显示,随着培养基中苯丙氨酸浓度的升高,淀粉酶的分泌及基因表达以及S6K1和4EBP1磷酸化水平均显著上升(P<0.05)。抑制S6K1蛋白的活化后,苯丙氨酸处理组淀粉酶活力显著下降(P<0.05)。CCK在胰酶分泌过程中发挥重要作用,本试验也对CCK及其刺激因子(苯丙氨酸)进行了研究,结果发现CCK能够直接刺激腺泡细胞分泌淀粉酶,与苯丙氨酸的作用机理不同。本试验结果表明,苯丙氨酸(0.45 mM)通过提高淀粉酶的mRNA表达,S6K1和4EBP1蛋白的磷酸化水平,从而促进蛋白质翻译起始复合物的形成,最终提高胰腺腺泡细胞的外分泌能力。试验二苯丙氨酸调控奶牛胰腺组织外分泌功能的分子机制基于细胞试验结果,本试验采用体外孵育胰腺组织法,通过检测添加苯丙氨酸对奶牛胰腺组织消化酶活力、相关mRNA表达和mTOR信号通路的影响,揭示苯丙氨酸调控胰腺组织外分泌功能的分子机制。选取2月龄健康的荷斯坦奶公犊牛,放血致死后采集胰腺立即进行组织孵育试验。苯丙氨酸处理浓度依据试验一设置:对照组(0 mM)和苯丙氨酸添加组(0.35 mM),每处理6重复,孵育时间为180 min,每60 min采集一次样品。结果显示,苯丙氨酸显著调控体外孵育奶牛胰腺组织消化酶的合成,并促进信号分子(S6K、4EBP1)的磷酸化,表明其机制是苯丙氨酸可能促进转录起始复合物的形成,进而提高胰腺组织蛋白质的合成。试验三亮氨酸调控奶牛胰腺腺泡细胞消化酶合成和分泌的分子机制本试验以新生奶公犊牛胰腺原代腺泡细胞为模型,研究亮氨酸对原代腺泡细胞消化酶合成和分泌影响的机理。试验设置4个亮氨酸浓度梯度,分别为0,0.23,0.45和0.90 mM,每处理6重复,培养时间为60 min。结果显示,随着亮氨酸浓度从0增加到0.45 mM:(1)胞内、胞外淀粉酶活力,培养基亮氨酸消耗量,酶原颗粒数量和体积,信号分子(PI3K、Akt、mTOR、S6K1)的磷酸化水平均显著上升(P<0.05);(2)培养基中异亮氨酸的消耗量减少,信号蛋白GCN2的表达显著下降(P<0.05);(3)信号分子4EBP1和eIF2α的磷酸化水平不受亮氨酸浓度的影响(P>0.05)。mTOR蛋白受其特异性抑制剂雷帕霉素抑制后,mTOR磷酸化水平和胞内淀粉酶合成显著降低(P<0.05)。与0.45 mM亮氨酸处理组相比,0.90 mM组的培养基中亮氨酸和异亮氨酸的消耗量以及PI3K/Akt的磷酸化水平显著下降(P<0.05)。Label-free蛋白质组学分析发现,4个处理组共有2009个差异表达蛋白,CC、MF、BP及KEGG pathway分析结果均发现,亮氨酸显著促进腺泡细胞线粒体内的氧化磷酸化过程(P<0.01)。柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶的活力随亮氨酸浓度的升高显著增加(P<0.05),高浓度亮氨酸组(0.45和0.90 mM)胞内ATP含量显著高于低浓度亮氨酸组(0和0.23mM)(P<0.05)。同时,亮氨酸显著提高蛋白质转运信号通路—SEC信号通路的活性(P<0.05)。试验结果表明,亮氨酸通过促进蛋白质合成信号网络,抑制蛋白质降解途径,提高淀粉酶的合成;同时,亮氨酸促进TCA循环关键酶柠檬酸合酶提高ATP产量,并激活SEC信号通路,进而促进淀粉酶的分泌。试验四亮氨酸调控奶牛胰腺组织消化酶合成的分子机制本试验采用体外孵育胰腺组织法,通过检测培养系统中添加亮氨酸对奶牛胰腺组织消化酶活力,mRNA表达和mTOR信号通路的影响,揭示亮氨酸调控奶牛胰腺组织消化酶合成的分子机制。胰腺组织孵育方法同试验二,亮氨酸处理浓度依据试验三设置:对照组(0 mM)和亮氨酸添加组(0.45 mM),每处理6重复,孵育时间为180 min,每60 min采集一次样品。结果显示,亮氨酸可增强奶牛胰腺组织中α-淀粉酶和胰蛋白酶的合成(P<0.05),且作为营养信号通过mTOR途径刺激α-淀粉酶和胰蛋白酶的合成。试验五亮氨酸和苯丙氨酸混合添加对奶牛胰腺外分泌功能的影响本试验采用体外孵育胰腺组织法,研究亮氨酸和苯丙氨酸混合添加对奶牛胰腺组织消化酶活力,mRNA表达和mTOR信号通路的影响。胰腺组织孵育方法同试验二。试验设置3个处理组,分别为对照组(两种氨基酸均不添加)、亮氨酸和苯丙氨酸添加组(0.45 mM亮氨酸+0.35 mM苯丙氨酸)、功能性氨基酸添加组(0.45 mM亮氨酸,0.35mM苯丙氨酸,0.23 mM缬氨酸,0.22 mM异亮氨酸),每处理6重复,孵育时间为180min,每60 min采集一次样品。结果显示,混合添加亮氨酸和苯丙氨酸显著提高(P<0.05)2 h、3 h胰蛋白酶(P<0.05)和2 h糜蛋白酶的活力,降低(P<0.05)1 h和2 h淀粉酶的活力;显著提高(P<0.05)1 h、2 h胰蛋白酶,1 h糜蛋白酶以及脂肪酶的mRNA表达;同时,提高(P<0.05)mTOR通路靶分子的磷酸化程度,降低(P<0.05)淀粉酶的活力。功能性氨基酸添加组对各消化酶活力的影响不显著(P>0.05)。这些结果表明,亮氨酸和苯丙氨酸混合添加对蛋白酶类分泌起到促进作用,但会抑制淀粉酶类分泌,在改善奶牛小肠淀粉消化率方面不适宜同时添加。本研究可获得2条结论:(1)苯丙氨酸通过促进胰酶mRNA表达和S6K1、4EBP1蛋白的磷酸化水平,提高胰腺淀粉酶的合成与分泌。(2)亮氨酸通过激活调控蛋白质合成最主要的信号通路PI3K/Akt-mTOR轴,并抑制蛋白质降解最主要的信号通路GCN2,提高奶牛胰腺腺泡细胞消化酶的合成;另一方面,亮氨酸通过促进胰腺腺泡细胞线粒体内的三羧酸循环和氧化磷酸化过程的关键酶柠檬酸合酶,增加胞内ATP含量,为蛋白质转运提供能量,并激活SEC信号通路,促进淀粉酶向胞外运输。