目的研究骨桥蛋白植入兔角膜后诱导角膜新生血管的形成情况及角膜新生血管周围微环境发生的变化,同时研究人角膜新生血管的微环境变化特点。探讨角膜新生血管的形成机制。方法(一)骨桥蛋白诱导兔角膜新生血管形成及其微环境的研究第一,建立角膜新生血管动物模型 应用角膜囊袋法制备兔角膜新生血管的动物模型。用5%水合氯醛耳缘静脉注射麻醉(5ml/Kg体重),倍诺喜(盐酸奥布卡因滴眼液)滴双眼角膜表面麻醉。在角膜中央做半厚切口长约3mm,用2mm宽的巩膜隧道刀逐渐向角膜缘分离并做潜行隧道,隧道顶端距角膜缘2mm。显微镜下,将骨桥蛋白缓释药丸植入兔左眼角膜囊袋内(实验组为OPN,对照组为PBS)。术毕眼裂涂金霉素眼膏。术后定期观察、裂隙灯照相及行组织病理学检查。第二,免疫组织化学方法检测角膜新生血管周围微环境的变化经骨桥蛋白诱导的新西兰大白兔20只,术后3、7、14、21天分别处死5只,取其角膜。对照组(PBS角膜囊袋植入组)20只,与实验组相同时间点分别处死5只。免疫荧光法检测兔角膜新生血管模型中α-SMA (α-平滑肌肌动蛋白)的表达情况并观察其与新生血管的关系。用CD31(血小板内皮细胞粘附因子)标记血管内皮细胞。免疫组化方法检测TGF-β1 (转化生长因子-β1)、VEGF (血管内皮细胞生长因子)的表达情况。 第三,分子生物学方法检测α-SMA及VEGF的表达新鲜角膜组织提取总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测α-SMA、VEGF在角膜中不同时间点的表达情况。Western-blot定量检测角膜新生血管微环境组分α-SMA、VEGF mRNA及蛋白水平变化。(二)人角膜新生血管微环境变化的研究具有新生血管的人角膜10只(各种病因导致的角膜新生血管,角膜移植术中取下),对照组为圆锥角膜病人的角膜10只,采用免疫组织化学方法检测角膜内是否存在激活的成纤维细胞标记蛋白FAP(成纤维细胞激活蛋白)的表达以及血管内皮标记因子CD31的表达。结果 (一)骨桥蛋白诱导兔角膜新生血管形成及周围微环境的变化1.角膜新生血管的形成情况骨桥蛋白缓释药丸植入后3天,角膜缘血管向角膜中央长入,角膜缘及结膜血管扩张充血,术后7天新生血管生长旺盛,出现大量角膜新生血管并持续至术后14天,随后角膜血管开始退缩减少。病理检查可见血管生长。对照组角膜未见新生血管的形成。2.免疫组织化学法检测角膜新生血管微环境的变化骨桥蛋白缓释药丸植入后3、7、14、21天免疫荧光染色显示：骨桥蛋白诱导组角膜内出现α-SMA阳性表达并且其表达水平与新生血管的形成一致,而对照组的正常角膜无阳性表达。免疫组织化学显示新生血管角膜内TGF-β1及VEGF阳性表达,术后7、14天表达量明显增加,对照组阴性表达。3.分子生物学方法检测α-SMA、VEGF的表达实时荧光定量RT-PCR及Western-blot结果显示,术后3、7、14、21天骨桥蛋白诱导组兔角膜均可见α-SMA、VEGF的表达,且术后7、14天α-SMA、VEGF的表达量较高。正常角膜内α-SMA、VEGF表达为阴性。(二)人角膜新生血管微环境变化的研究免疫组织化学染色可见具有新生血管的人角膜FAP及CD31的表达为阳性,对照组角膜未见FAP及CD31的表达。结论骨桥蛋白可以诱导角膜新生血管的形成；在角膜新生血管形成时,其周围微环境发生变化,出现细胞因子、细胞外基质等组分表达的变化,角膜新生血管周围微环境对于新生血管的形成起到一定作用。