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香石竹（Dianthus caryophyllus L.）是世界四大切花之一，在花卉市场中占有重要地位。延长瓶插寿命对延长观赏期和调节流通有重要作用。传统的保鲜方法多采用乙烯抑制剂或乙烯拮抗剂的保鲜剂，但这些化学物质多会造成环境污染，且成本较高。本研究通过克隆香石竹ACC氧化酶（ACO）基因，将其构建成不同T-DNA结构的植物表达载体，并导入香石竹不同品种，分析转基因香石竹切花的瓶插寿命。 1 ACO基因的克隆及其植物表达载体的构建 根据已发表的香石竹ACO基因序列，设计一对特异引物，以香石竹品种‘America’基因组DNA为模板，扩增出香石竹ACO基因，将其连接到pMD18-T质粒载体上，对序列测定结果与已发表的ACO基因cDNA序列进行对比分析显示，该克隆片段含3个外显子，2个内含子，外显子序列与已发表的ACO基因cDNA序列完全一致。通过中间载体pBluescript SK和pIC19R，经PCR分析及酶切检测，成功地构建了ACO基因正义、反义、正义重复和反义重复等4种不同T-DNA结构的植物表达载体，并用冻融法将该4种植物表达载体导入了农杆菌LBA4404菌株。 2 香石竹5个品种再生体系的建立 采用香石竹无菌苗叶片为外植体，建立了香石竹5个品种‘Aicardi’、‘Master’、‘Yellow Star’、‘Opera’和‘Mabel’的再生体系。幼叶比老叶分化率高，叶片在含BA和TDZ两种细胞分裂素中都可以分化，但在含TDZ培养基中，不定芽玻璃化程度较高，且发现AgNO3（0-25 mmol／L）对不定芽分化起抑制作用，因此选用MS+NAA 0.3mg／L+BA 1.0mg／L为分化培养基，5个品种的再生率在38.6％与61.8％之间。无菌苗茎段在R1（MS+NAA 0.1mg／L）、R2（MS+IBA 0.1mg／L）和R3（MS+IAA 0.1mg／L）三种培养基中均能生根，但以R1培养基生根率最高（100％）。无菌苗生根后经炼苗移栽至河沙、珍珠岩和腐叶土的3种基质中，结果表明在珍珠岩中的成活率（78.7％）明显高于河沙和腐叶土。 3 香石竹5个品种的遗传转化 用农杆菌介导法对上述5个品种进行了遗传转化。实验表明：香石竹对潮霉素比较敏感，叶片分化选择压力为4-5mg／L。在转化过程中对预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度以及共培养时间等转化条件进行了摸索。将香石竹叶片在分化培养基上预培养2天，于根癌农杆菌菌液(OD600值为0.6-0.9)侵染8-12min,在含100mmol／L的乙酰丁香酮的培养基上共培养3d，转移到选择培养基（MS+NAA 0.3mg／L+BA 1.0mg／L+Hyg 4mg／L+Cef 400mg／L）中培养，剔除 华中农业大学博士学位毕业论文选择培养前两周分化出的腋芽，每3周换一次培养基。在此期间，抗性芽长至1 cm时切下转移到选择生根培养基（MS+NAA 0.1 mg/L十Hyg 4.0 mg几）中生根培养。不同品种抗性芽分化率在4.3%和11 .2%之间，4转基因植株的获得及检测 比较四种提取香石竹基因组DNA的方法，其中改良SDS法所提DNA较纯，且拖带较少。抗性不定芽在选择生根培养基上生根率为48.3%，PCR扩增HPT基因表明，24.5%的抗性生根植株为阳性。Southem杂交证实，14.2%的抗性生根植株外源基因已整合到植物基因组中。共得到33株转化株系，其中30株为单拷贝，3株为两个拷贝。5不同T一DNA结构导入后对香石竹瓶插寿命及乙烯释放量的影响 分析了4种T一DNA结构导入‘Master’、‘Mabel’和‘Yellow Star’3个香石竹品种17个转化株系瓶插寿命及部分株系乙烯释放量的测定结果。 在转化‘Master’品种正义ACO基因的3株转化株系中，有l株瓶插寿命显著延长;在转化反义ACO基因的4株转化株系中，3株瓶插寿命显著延长;在转化正义重复ACO基因的2株转化株系瓶插寿命显著延长，抑制乙烯生成达90%以上;在转化反义重复ACO基因的3株转化株系中，瓶插寿命都显著延长，延长的时间较长 （达12d以上），而且抑制乙烯生成达100%。 以上结果表明，4种结构的T一DNA均能在一定程度上抑制内源基因的表达，相比之下，反义强于正义，重复基因结构强于单一基因结构。6转化同一T一DNA结构不同品种间的瓶插寿命比较。 在转化‘Master’品种的n株系中有8株瓶插寿命得以显著延长，在转化Mabel’品种的3株系中有l株瓶插寿命得以显著延长，在转化‘Yelfow Star’只有1株，其瓶插寿命得以显著延长。 转化同一T-DNA结构不同品种间的瓶插寿命有一定差异。在转化正义ACO基因的‘Master’品种3株系中有1株系瓶插寿命得以显著延长，‘Mabel’品种2株系瓶插寿命都未延长;在转化反义ACO基因的‘Master’品种的4株系中有3株系延长，‘Yellowst盯’品种1转化株系瓶插寿命延长;在转化正义重复ACO基因的 ‘Master’品种的2株系瓶插寿命均达12d左右，‘Mabel’品种2株系有1株系瓶插寿命延长。 另在同一株系的不同花朵之间瓶插寿命也存在着差异，可能是转化嵌合体所致。