脑血管病是威胁人类健康的三大疾病之一，在很多国家，它都是致死的主要原因和成人致残的首要原因。其中，缺血性脑卒中又是脑血管病的最常见者，约占70%。由于其生存者致残率高，给患者个人及家庭和社会带来沉重负担。但迄今为止，卒中的药物治疗并没有多大进展。为了开发有临床价值的神经保护因子，加深对梗死灶进展机理的理解已引起了学者们的高度重视。有证据表明星形胶质细胞与神经元之间存在密切的关系。星形胶质细胞间通过缝隙连接构成功能性合胞体。缝隙连接对于分子量小于1.2kDa的物质具有相对自由的通透性，支持星形胶质细胞间扩散代谢产物及空间缓冲钾离子等重要功能离子。这个功能性细胞间网络的存在引起学术界的关注，也为解释半影区神经元的迟发性死亡和梗死灶的扩展提供了多种假说。在此背景上，本实验着手研究星形胶质细胞的缝隙连接功能在局灶性脑梗死中的变化规律、调控机理及其功能变化对梗死体积扩展的影响意义，希望能对探寻新的治疗手段或方案有所裨益。第一部分　　文献综述通过总结国内外的研究资料，本论文就星形胶质细胞缝隙连接的研究现状、星形胶质细胞的体外培养方法和星形胶质细胞缝隙连接与缺血脑卒中的关系三个方面进行了综述。第二部分　　体外实验 <WP=105>为了能够更方便地研究星形胶质细胞缝隙连接的功能及变化，进行了大鼠成层星形胶质细胞的纯化培养，并抽取缺血性卒中的构成要素——缺氧，建立了缺氧/再复氧模型。以24h内Wistar大乳鼠大脑皮质为原料，采用Manthorp连续传代法，体外纯化培养星形胶质细胞。培养基成份为含20%小牛血清的DMEM。培养环境为95%空气5%CO2，饱和湿度，37℃。细胞经连续传代3～4代后，通过对培养细胞进行形态学观察和GFAP免疫细胞化学鉴定，证明本实验取得的培养物为大鼠皮层星形胶质细胞，细胞纯度约为95%。随后采用缺氧孵箱法，将培养达80%融合的细胞置于N289%/CO25%/O27%环境中缺氧24h/再复氧6h，建立星形胶质细胞缺氧/再复氧模型。细胞形态学观察显示：缺氧期细胞改变不明显，但再复氧后细胞出现损伤表现，并随时间延长愈益突出。这一结果证明体外纯化培养星形胶质细胞的缺氧/再复氧模型建立成功。为了研究星形胶质细胞缝隙连接功能的变化，本实验进行了培养细胞的染料偶联研究。配制5%荧光黄染料，采取直接显微注射的方法，在每个培养皿内随机注射至少10个细胞，在最后一个细胞注射结束后20min于荧光显微镜下观察计数偶联发生率和偶联系数。结果表明：体外培养星形胶质细胞的缝隙连接在缺氧/再复氧条件下仍保持开放；缺氧对缝隙连接功能没有明显影响；但再复氧后星形胶质细胞GJ功能显著降低，至再复氧3h达最低值，仅为正常对照组水平的1/4，在再复氧6h，染料偶联系数出现回升，提示缝隙连接功能的这一变化可能为一过性的改变。为了初步探讨其变化的机理，本实验采用Western blot法，观察体外培养星形胶质细胞缺氧/再复氧模型中星形胶质细胞缝隙连接的结构基础主体——Cx43的变化。结果表明各组在蛋白水平上均没有明显变化。由此缺氧/再复氧早期GJ功能下降并不是缝隙连接蛋白表达水平的变化，而很可能是其功能水平的改变。其可能的机理包括缝隙连接蛋白构象变化（特别是磷酸化水平的改变）及蛋白的内化等。第三部分　　体内实验本实验采用线栓法制备大鼠MCAO/R模型。在实验过程中，对Longa的方法进行了改进。通过观察成模后大鼠的症状体征，同时应用神经病学评分、TTC染色计算梗死灶体积等方法对模型进行了评价。结果表明：改进后的方法简便<WP=106>易行，模型成功率高，稳定性较好。本实验制作的动物模型与缺血性脑卒中的临床表现和病理改变相似，认为其确为研究局灶性缺血性脑卒中较为理想的模型。随后进行了缝隙连接阻断剂辛醇的在体干预对照实验。本节实验设6组，其中假手术组和对照组（缺血24h组和缺血6h/再灌注6h组）于术前30min腹腔内注射生理盐水，辛醇组术前30min腹腔内注射辛醇溶液，DMSO组为缺血6h/再灌注6h组＋术前30腹腔内注射等体积DMSO溶剂。除假手术组外，各组动物在术后均出现明显的神经功能缺损表现，但辛醇组与手术对照组在缺血和缺血/再灌注条件下神经功能缺损程度没有区别。各组动物在时间点取脑，进行梗死灶TTC染色，结果经图像分析软件处理。辛醇干预组与对照组比较，梗死体积明显减小。DMSO组对与缺血6h/再灌注6h组比较，梗死体积无差异，表明DMSO溶剂对实验指标没有干扰。本项研究表明，缝隙连接阻断剂辛醇有效地减小了大鼠大脑中动脉缺血/再灌注损伤的梗死体积，减小程度接近30%。这一结果提示缝隙连接的功能影响了缺血性卒中梗死体积的扩展过程。在体外实验中观察到的星形胶质细胞缝隙连接功能的降低可能是机体的一个保护性反应。抑制缝隙连接的功能可以减少缺血中心区的有害物质向半影区传播，对挽救半影区细胞可能具有一定的积极意义，或可在缺血性脑卒中的病理进程中起到神经保护作用。加深对缝隙连接调控机理的研究，尝试抑制缝隙连接的有效方法，也许能为缺血性脑卒中的治疗开启新的思路。