鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)属野豌豆族(Vicieae)鹰嘴豆属(Cicer),又叫做桃豆、鸡豌豆、羊头豆、脑豆子、诺胡提(维语),在我国新疆已有2500年的种植历史。其籽粒营养成分全,含量高,营养丰富,是一种重要的粮食来源,并具有一定的药用价值。a-淀粉酶抑制剂在植物中普遍存在,由于其对α-淀粉酶有很强的特异性抑制作用,在植物防止病虫害侵害等方面具有重要作用。因此,对鹰嘴豆种子所含α-淀粉酶抑制剂进行研究将具有一定重要意义。本论文分别从鹰嘴豆种子中a-淀粉酶抑制剂的提取和抑制活性测定、不同品种间的差异分析、分离纯化、基因克隆、子叶和胚中的抑制活性的分析、生物学特性、酶学特性以及抗氧化特性方面进行了研究。其主要结论如下：一、以人的唾液α-淀粉酶(HSA)为示踪检测剂,以淀粉为底物,通过过-DNS法,对鹰嘴豆种子中的α-淀粉酶抑制剂的粗提取影响因素进行了探讨,结果表明：以20mmol/L、pH8.0的Tris-HC1缓冲液作提取液,料液比为1：5(W/V)时,提取液抑制活力最大；70℃水浴5 mmin时,提取液抑制活力保存最大。二、比较34个鹰嘴豆品种的α-淀粉酶抑制剂抑制活力的差异,结果表明：Kaubli品种种子蛋白质含量与其α-淀粉酶抑制剂抑制活力呈极显著(P<0.01)正相关,相关系数r=0.317,而淀粉含量与α-淀粉酶抑制剂抑制活力呈显著(P<0.05)负相关,相关系数r=-0.281；Desil品种的相关性分析表明种子蛋白质含量与淀粉酶抑制剂抑制活力之间,以及淀粉含量与淀粉酶抑制剂抑制活力之间无明显相关性(P>0.05)。鹰嘴豆种子中α-淀粉酶抑制剂抑制活力在不同品种间差异达到极显著水平(P<0.05),表明鹰嘴豆种子中α-淀粉酶抑制剂抑制活力在不同品种间存在显著的基因型差异。Kaubli和Desil品种的α-淀粉酶抑制剂抑制活力变幅分别为7.3～87.9和16.9～118.4 U/g,变异系数分别为47.80%和65.36%。34个品种a-淀粉酶抑制剂的抑制活力呈偏态分布,抑制活力在20.0～60.0 U/g的品种数占总品种数的61.8%。采用系统聚类法,34个鹰嘴豆品种被聚为4大类群,其品种数分别为1、7、12、14。三、对鹰嘴豆种子蛋白质样α-淀粉酶抑制剂进行了分离纯化和序列分析,结果表明：粗提液的硫酸铵分级沉淀,α-淀粉酶抑制剂主要存在于组分Ⅲ(60～80%)和Ⅳ(80～100%)中；Ⅲ和Ⅳ的合并液用于离子交换色谱,结果显示有一个分离峰具有相对较高的抑制活性；具有活性的峰收集液用作反相色谱,7个峰被洗脱下来,其中峰5具最高的抑制活力(74.1%)；峰5的收集液经真空冷冻干燥,得到的粉末再经胰蛋白酶水解后,高效液相串联质谱(UPLC/MS-MS)检测得到三个肽片段,分别为LHQNIGSSSSPDIYNPQAGR (片段1,残基数20)、YQQEGSEEEENEGGNIFSGFK (段2,残基数21)和FYLAGNHEQEFLR (片段3,残基数13)。经联网进行序列比对,三个片段的序列与与鹰嘴豆球蛋白Q9SMJ4序列相似性达到100%,因此我们纯化获得的α-淀粉酶抑制剂可识别为鹰嘴豆球蛋白,其分子量为25.947 kDa,同时推测其可能为鹰嘴豆球蛋白(Q9SMJ4)的一个亚基；进一步将其氨基酸序列与其它已知几类a-淀粉酶抑制剂氨基酸序列进行比对,相似性很低(0～26%),说明我们纯化获得的α-淀粉酶抑制剂在氨基酸序列上不同于已知的α-淀粉酶抑制剂类型。四、根据部分氨基酸序列以及相似性很高的Q9SMJ4蛋白的基因序列设计引物,克隆出一球蛋白样α-淀粉酶抑制剂候选基因,其ORF全长1494 bp,编码497个氨基酸,与Q9SMJ4蛋白的相似性为88%。五、对鹰嘴豆种子子叶和胚分别进行α-淀粉酶抑制剂的提取,并对提取液进行了抑制活性检测,结果表明对真菌(Bacillus subtilis)来源的α-淀粉酶,子叶和胚提取液均未检测到抑制活性；对HSA和PPA,胚提取液抑制活力分别为46.9%和4.3%,子叶提取液对HSA的抑制活力为32.1%,而对PPA则没有检测到抑制活力；对从植物来源的α-淀粉酶(PA),子叶提取液未检测到抑制活力,而胚提取液则具有较好的抑制活力；而对细菌(Aspergillus oryzae)来源的α-淀粉酶子叶和胚提取液抑制活性大小相近。鹰嘴豆种子发芽1d后,子叶和胚提取液对细菌来源的α-淀粉酶抑制活性迅速降低,发芽4 d后,子叶和胚提取液已经检测不到抑制活性；发芽1 d后,胚提取液已检测不到对HSA的抑制活性,而在子叶提取液中还有部分抑制活力,发芽5d后,在子叶中已检测不到抑制活性；发芽1d后,无论子叶提取液还是胚提取液对PPA和PA都检测不到抑制活力。开花后10 d,鹰嘴豆种子子叶提取液和胚提取液开始检测到对HSA和细菌来源的α-淀粉酶的抑制活性,30 d时达到最大；对PA,胚提取液抑制活性在30d时达到最大,而在子叶提取液中均未检测到抑制活性。α-淀粉酶抑制剂粗提液对HSA和PA有抑制活性,分别为46.9%和46.6%；对真菌、细菌源α-淀粉酶和PPA有较低或几乎没有抑制活性。而纯化后的蛋白质样α-淀粉酶抑制剂对HSA、PA和PPA都具有较高的抑制活性,分别为73.6%,67.3%和80.3%；对真菌和细菌源α-淀粉酶则没有检测到或有较低的抑制活力。与粗提液相比,纯化后的蛋白质样α-淀粉酶抑制剂对HSA、PA和PPA的抑制活性都有所提高。六、对蛋白质样α-淀粉酶抑制剂的部分酶学特性的研究结果表明：蛋白质样α-淀粉酶抑制剂对三种α-淀粉酶(HSA,PPA和PA)的抑制作用的最适温度在37～40℃之间,最适pH值为6.5时,对PPA和PA而言,抑制剂的抑制活性范围为pH4.0～8.5,而对HSA而言,其抑制活性范围为pH4.0～9.5；抑制剂对三种α-淀粉酶的抑制活性随着共培养时间的延长而增加,其中对HSA和PA的抑制活性在20 mmin时达到最大,而对PPA的抑制活性则在30 min时达到最大；在底物浓度为1%时,抑制剂对HSA和PPA的抑制活力最大,而对PA的抑制活性,则在1.5%时最大；抑制剂浓度在0.07～0.32 mg/mL的范围内时,其对HSA、PPA和PA的抑制活性随浓度增加而增加；抑制剂对HSA,PPA和PA最大半抑制浓度分别由线性关系式y=203.7x+4.744(R20.944),y=133.4 x+33.04(R20.944), y=186.6x-2.881(R2=0.991),求得ID50=8.56×10-6mol/L,4.89×10-6mol/L和1.09x10-5mol/L；抑制剂与α-淀粉酶的结合和底物之间呈混合型非竞争性抑制,抑制常数Ki分别1.668x10-5 mol/L,1.864x10-5 mol/L和3.037x10-5 mol/L；Ksi分别为1.427x10-5 mol/L, 1.558×10-5 mol/L和1.410×10-5 mol/L七、考察了从提取到硫酸铵分级沉淀、离子交换色谱和反相液相色谱三步纯化步骤获得的a-淀粉酶抑制剂的生物活性。结果表明：α-淀粉酶抑制剂具有一定的清除自由基和还原能力；在一定的反应体系中,抑制剂的清除自由基和还原能力不仅随浓度(一定浓度范围内)增加而增加,也随纯度的增加而增强。