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目的:研究毛喉素、木犀草素、白藜芦醇联用对三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)细胞内环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monop Hosp Hate,c AMP)的影响,探讨三药联用对三阴性乳腺癌细胞转移、干性的抑制作用;揭示三药联用通过增加细胞内c AMP含量抑制三阴性乳腺癌细胞转移、干性的作用机制并为后续研究和临床应用提供科学的前期基础。方法:1.毛喉素、木犀草素、白藜芦醇联用抑制三阴性乳腺癌细胞转移及机制研究以三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT549为研究对象,实验分组:空白对照组(DMSO),阳性对照组:三化药(毛喉素+咯利普兰+丙磺舒),天然产物组:三中药(毛喉素+木犀草素+白藜芦醇)。应用现代细胞分子生物学和药理学技术方法:通过q RT-PCR,在基因水平上验证木犀草素对磷酸二酯酶(PDE4)表达的影响、白藜芦醇对多药耐药蛋白(MRP1)表达的影响;通过ELISA技术检测三组MDA-MB-231、BT549细胞内c AMP含量,考察天然产物组是否对维持TNBC细胞内c AMP的稳态有效;通过细胞迁移、侵袭、划痕实验及建立三阴性乳腺癌肺转移模型,观察各组动物模型给药后的精神状况,给药6周后取肺组织,统计裸鼠肺转移灶数量,肺组织HE染色实验,分析毛喉素、木犀草素、白藜芦醇联用对细胞生长、转移的抑制作用。通过western-blot检测三阴性乳腺癌细胞药物作用后EMT相关蛋白的表达,探究三药联用抑制三阴性乳腺癌转移的作用机制。2.毛喉素、木犀草素、白藜芦醇联用抑制三阴性乳腺癌细胞干性的机制研究在裸鼠第三对乳房垫建立三阴性乳腺癌原位瘤模型,观察各组给药后的精神状况、体重变化的影响,比较各组瘤体大小;建立MDA-MB-231细胞克隆球实验,观察三药联用对三阴性乳腺癌干细胞克隆球形成的影响;通过流式细胞术进一步检测用药后细胞内干性相关蛋白CD44的表达;采用Western-Blot方法,从蛋白水平考察三种天然产物联用对细胞干性及位于c AMP下游的hedgehog信号通路等相关蛋白表达的影响,探究三中药联用抑制三阴性乳腺癌干性的作用机制。结果:1.通过q RT-PCR实验,我们发现木犀草素能够抑制PDE4的活性,可以达到甚至超过西药咯利普兰对c AMP水解的抑制作用,而白藜芦醇抑制MRP1表达,同样可以取代西药丙磺舒减少c AMP外排的效果,共同维持细胞内c AMP含量的稳态。通过ELISA技术我们发现,三中药组相较于空白对照组,能够更明显的升高细胞内c AMP的含量,作用效果等同于化药组;在细胞划痕、迁移及侵袭实验中,我们发现,三中药组同样可以抑制细胞转移,效果甚至优于化药组。观察各组动物模型给药后的精神状况,三中药组给药后,裸鼠不良反应较化药组明显减少。给药6周后取肺组织,统计裸鼠肺转移灶数量,中药组与化药组肺结节数相较于DMSO组均有明显减少。肺组织HE进行染色,三中药组肺组织切片几乎看不到转移灶。通过western-blot检测三阴性乳腺癌细胞给药后EMT相关蛋白的表达,其中Snail、Slug、TCF8、ZO-1以及助转移的波形蛋白Vimentin的表达,均呈现不同程度的降低,进一步证实了三药联用抑制三阴性乳腺癌的转移。2.建立裸鼠原位瘤模型,观察各组给药后的精神状况,裸鼠表现与尾静脉模型给药后基本一致,中药组副作用明显低于化药组。记录裸鼠体重变化,中药组体重普遍高于其他两组,生存状态优于化药组。绘制裸鼠生存曲线,DMSO组存活率明显降低,中药组存活率最高,存活时间最长,且精神状态较之于前两组表现的最好。比较各组瘤体大小,可以看出,三中药联用对于TNBC原位瘤的生长有明显的抑制作用。观察三组MDA-MB-231干细胞克隆球的形成,发现毛喉素、木犀草素、白藜芦醇联用能明显抑制TNBC细胞MDA-MB-231干细胞克隆球的形成,同时降低肿瘤球的大小;流式细胞术显示,三中药组中,肿瘤干细胞标志物CD44的表达明显低于空白组及化药组。通过Western-Blot实验,三中药组与空白对照组相比,细胞干性相关蛋白CD44、Nanog等表达均明显下降,抑制hedgehog信号通路,实验结果与预期一致,可取代副作用明显的化药组。结论:天然产物毛喉素与对多药耐药蛋白有抑制作用的白藜芦醇、对磷酸二酯酶有抑制作用的木犀草素联用,能够明显提高三阴性乳腺癌细胞内c AMP的浓度,从而抑制三阴性乳腺癌细胞的转移和干性,其效果甚至优于前期实验研究已知有效的阳性对照组(毛喉素+咯利普兰+丙磺舒)。伴随着进一步的研究结果,肿瘤干细胞的衰减,肿瘤干细胞表面标志物蛋白CD44、Nanog表达量的降低;转移相关蛋白Vimentin等表达量的减少,以及Hedgehog信号通路蛋白表达量的改变,提示我们毛喉素、木犀草素、白藜芦醇三药联用对三阴性乳腺癌转移、干性的抑制作用与Hedgehog信号通路密切相关。