【摘 要】
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骨骼和肌肉均起源于中胚层,它们在解剖位置上彼此相邻,更有利于二者通过力学信号和化学信息方面进行交流。一方面,骨骼为肌肉提供附着面,进而影响骨骼的结构。另一方面,它们可以通过传递化学信息来相互影响,但作用机制还不清楚。前期研究发现,肉鸭胸骨钙化过程与胸肉发育存在协同性,我们认为:骨骼钙化过程中的分泌蛋白,可能通过旁分泌途径调控了肌肉的发育过程。为研究骨骼分泌蛋白对肌肉发育的影响,本研究拟以农华麻羽肉
【基金项目】
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国家重点研发项目（批准号2018YFD0501500）； 四川省畜禽育种攻关（2011NZ0099-8）； 国家自然科学基金（批准号31872345）孵化温度影响鸭胚胎骨骼肌发育的分子网络构建与调控；
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骨骼和肌肉均起源于中胚层,它们在解剖位置上彼此相邻,更有利于二者通过力学信号和化学信息方面进行交流。一方面,骨骼为肌肉提供附着面,进而影响骨骼的结构。另一方面,它们可以通过传递化学信息来相互影响,但作用机制还不清楚。前期研究发现,肉鸭胸骨钙化过程与胸肉发育存在协同性,我们认为:骨骼钙化过程中的分泌蛋白,可能通过旁分泌途径调控了肌肉的发育过程。为研究骨骼分泌蛋白对肌肉发育的影响,本研究拟以农华麻羽肉鸭（GF2系）为研究对象,通过转录组测序技术,分析骨骼钙化过程中差异基因的表达,筛选参与骨骼钙化过程的骨分泌蛋白,并在细胞水平上研究骨分泌蛋白在鸭成肌细胞增殖和分化中的作用。本研究获得的主要结果如下:（1）鸭胸骨与胸肉交界处的H&E染色和免疫荧光结果表明,钙化的胸骨上附着肌肉的肌细胞核比未钙化组多,且钙化组对应的肌肉中肌细胞的PCNA阳性数量明显多于未钙化组,说明胸骨钙化过程促进胸肉发育。（2）鸭胸骨钙化部位和未钙化部位测序得到328个差异基因。它们主要富集的GO条目有骨吸收正向调节、BMP信号通路、免疫应答、软骨细胞分化负调控等。KEGG富集分析发现差异表达基因主要富集于病灶粘附、细胞外基质-受体相互作用、转化生长因子-β信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等信号通路。（3）通过鸭胸骨钙化部位和未钙化部位测序,我们筛选到195个分泌蛋白。根据基因表达能同时满足:在钙化和未钙化组的胸骨中表达差异显著（|Log2FC|>3,P<0.05）,及在对应胸肉中表达量极低（FPKM的平均值<0.2）的标准,共筛选到12个分泌蛋白,这些分泌蛋白可能由胸骨钙化过程中特异表达的基因所编码。其中骨抑制因子SOST和DKK1是骨细胞特异分泌的蛋白,近年来被报道影响成肌细胞的发育。（4）在鸭成肌细胞增殖期过表达SOST基因,细胞培养12h、36h、48h处理组的细胞增殖率显著低于对照组（P<0.05）。Ed U结果显示处理组阳性细胞率显著低于对照组（P<0.05）。流式细胞检测结果表明,处理组和对照组处于G0/G1期的细胞数无明显差异,说明SOST对成肌细胞增殖影响不明显。在鸭成肌细胞分化期过表达SOST基因,免疫荧光结果显示肌管形成受阻,分化相关基因My HC的蛋白表达量与对照组不显著。（5）过表达SOST基因后,诱导分化2 d的成肌细胞中,转录组测序筛选到331个差异表达基因（P<0.05,差异倍数>1.8）。GO分析显示差异基因主要富集于发育相关的细胞过程。KEGG结果显示差异基因主要富集于肌肉发育、细胞间调节和疾病相关信号通路。（6）在鸭成肌细胞增殖期过表达DKK1基因,细胞培养12h、36h、48h处理组细胞增殖速率显著低于对照组（P<0.05）。Ed U结果显示处理组阳性细胞率显著低于对照组（P<0.05）。流式细胞检测结果发现处理组和对照组处于G0/G1期的细胞数无明显差异。在鸭成肌细胞分化期过表达DKK1基因,细胞免疫荧光显示,肌管形成受阻。相反地,干扰DKK1基因的表达后促进肌管形成。分化相关基因My HC的蛋白表达量在过表达48h后低于对照组,但不显著,在干扰48h后显著高于对照组（P<0.05）。说明DKK1基因的表达抑制了鸭成肌细胞的分化。（7）过表达DKK1基因后,诱导分化2 d的成肌细胞中,转录组测序共检测到232个差异表达基因（P<0.05,差异倍数>1.8）。GO分析显示差异基因主要富集于肌肉发育相关的条目,如骨骼肌组织发育、横纹肌组织发育和肌肉收缩等方面。KEGG主要富集到细胞分化相关的通路,提示DKK1可能通过这些信号通路影响鸭成肌细胞的分化。综上,本研究证实鸭胸肉发育与胸骨钙化过程有关。胸骨钙化过程中的骨分泌蛋白SOST和DKK1可能通过抑制成肌细胞分化过程而抑制胸肉发育。本研究为提升肉鸭产量提供理论依据。
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