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第一部分:FAM135B的表达状态影响食管鳞癌细胞放射敏感性的研究目的:探究FAM135B在食管鳞癌细胞中的表达状态,以及FAM135B的表达状态与食管鳞癌细胞放射敏感性的关系。方法:通过RT-PCR及免疫印迹法检测SHEE细胞（永生化食管上皮细胞）及5种食管鳞癌细胞中FAM135B的表达情况。克隆形成实验评价FAM135B的表达状态对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响。利用siRNA沉默食管鳞癌细胞ECA109和KYSE150中的FAM135B的表达,再利用克隆形成实验评价siRNA干扰FAM135B表达后的食管鳞癌细胞ECA109和KYSE150的放射敏感性的变化。结果:RT-PCR结果表明,在检测的5个食管癌细胞系（TE-1、TE-10、TE-13、ECA109 和 KYSE150）中,FAM135B mRNA 的表达水平较 SHEE 细胞高,TE-1、TE-10、TE-13、ECA109 和 KYSE150 食管癌细胞中的 FAM135B mRNA 表达分别是 SHEE 的 2.19 倍、8.98 倍、8.02 倍、7.65 倍和 12.4 倍。TE-10、TE-13、ECA109和KYSE150组的FAM135B mRNA的表达与SHEE组的比较有统计学差异（P＜0.05）。Western blot检测表明,4个食管癌细胞系（TE-10、TE-13、ECA109和KYSE150）中,FAM135B蛋白的表达水平较SHEE细胞的高,TE-1细胞中的FAM135B蛋白表达水平与 SHEE 细胞的相当。在 SHEE、TE-1、TE-10、TE-13、ECA109 和 KYSE150这6组细胞的克隆形成实验中发现,TE-1、TE-10、TE-13、ECA109和KYSE150细胞的细胞存活分数在相应的辐照剂量下均较SHEE细胞的高,在五组食管癌细胞之间,FAM135B高表达的食管癌细胞较低表达的细胞存活分数高。SHEE、TE-1、TE-10、TE-13、ECA109 和 KYSE150 细胞的 D0值分别是 1.02、1.36、1.54、1.79、1.65 和1.69,在2 Gy照射剂量下存活分数（SF2）分别是:0.46、0.56、0.60、0.65、0.66和0.76,5组食管癌细胞的SF2与SHEE组的比较,在统计学上均有显著性差异（P＜0.05）。TE-1、TE-10、TE-13、ECA109 和 KYSE150 细胞的放射增敏比分别是 0.75、0.66、0.57、0.62和0.60。利用siRNA干扰技术,我们成功构建了 FAM135B敲低细胞（ECA109-FAM135B siRNA 和 KYSE150-FAM135B siRNA）和 FAM135B 敲低对照细胞（ECA109-NC siRNA和KYSE150-NC siRNA）。克隆形成实验结果表明,ECA109-FAM135B siRNA 和 KYSE150-FAM135B siRNA细胞 2 Gy 照射剂量下存活分数分别是:0.44和0.41,其与FAM135B敲低对照组比较有统计学差异（P＜0.05）。ECA109-FAM135B siRNA 和 KYSE150-FAM135B siRNA 细胞的放射增敏比分别是:1.21和1.38。结论:FAM135B在食管鳞癌细胞中高表达,FAM135B的表达状态与食管鳞癌细胞的放射敏感性呈负相关。FAM135B的表达下调后,食管鳞癌细胞的放射敏感性增加。第二部分:siRNA干扰FAM135B增加食管鳞癌细胞放射敏感性的相关机制研究目的:探究siRNA干扰FAM135B增加食管鳞癌细胞放射敏感性的相关机制。方法:通过转录组测序（RNA-seq）寻找FAM135B调控的信号传导通路,并通过蛋白印迹验证FAM135B调控该信号通路的关键蛋白。通过MTT法检测信号通路抑制剂（雷帕霉素）对食管鳞癌细胞的细胞毒效应,得出药物的50%抑制浓度（IC50）值。通过流式细胞仪主要分析无辐照和辐照下KYSE150细胞和KYSE150-FAM135B siRNA细胞的细胞凋亡和周期分布的差异,以及联合雷帕霉素对细胞周期分布的影响。蛋白印迹分析KYSE150细胞和KYSE150-FAM135B siRNA细胞在无辐照和辐照下的P53、pP53、CDK1、Bcl-2、Bax蛋白的表达差异,以及联合雷帕霉素对细胞周期蛋白和凋亡相关蛋白表达的影响。克隆形成实验分析辐照下KYSE150细胞和KYSE150-FAM135B siRNA细胞的克隆形成,以及联合雷帕霉素对细胞克隆形成的影响。结果:转录组测序分析表明,KYSE150-FAM135B siRNA细胞与KYSE150细胞比较,有327个基因上调,520个基因下调,12203个基因无明显变化。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析显示,PI3K/Akt/mTOR 信号通路可能是受FAM135B调控的下游信号通路。蛋白印迹分析结果表明,食管癌细胞KYSE150中FAM135B表达调低后,会引起PI3K/Akt/mTOR通路中的关键蛋白PI3K、mTOR、p-Akt、p-mTOR表达下降,提示PI3K/Akt/mTOR通路中的关键蛋白受FAM135B调控。MTT法检测雷帕霉素对KYSE150和KYSE150-FAM135B siRNA细胞的细胞毒效应,结果表明,KYSE150细胞的雷帕霉素24h、48h和72h的50%抑制浓度分别是:128.2nM、84.48nM 和 72.23nM,KYSE150-FAM135B siRNA 细胞的雷帕霉素 24h、48h和72h的50%抑制浓度分别是:83.07nM、76.49nM和67.47nM。流式细胞仪检测KYSE150和KYSE150-FAM135B siRNA细胞的细胞周期变化,结果发现,KYSE150细胞的G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例分别为:87.84±3.40%、4.83±2.22%、6.47±2.42%,KYSE150-FAM135B siRNA 细胞的 G0/G1 期、S 期、G2/M 期细胞比例分别为:62.33±8.92%、20.96±8.18%、13.32±2.88%。KYSE150-FAM135B siRNA 细胞的G2/M期细胞比例明显比KYSE150细胞的高,且有统计学差异（P＜0.05）。蛋白印迹分析显示,pP53、CDK1蛋白在KYSE150-FAM135B siRNA细胞中的表达较KYSE150 细胞的低,而 P53、Bcl-2、Bax 蛋白表达在 KYSE150 和 KYSE150-FAM135B siRNA细胞中表达无明显变化。克隆形成实验发现,辐照后的对照组（6Gy RT）、雷帕霉素组（Rapamycin+6Gy RT）、干扰组（FAM135B siRNA+6Gy RT）、联合组（Rapamycin+FAM135B siRNA+6Gy RT）的克隆数分别是:263.67±11.15 个、93.67±8.50个、26.67±3.51个、17.67±4.04个。干扰组、雷帕霉素组、联合组克隆数明显较对照组少,且有统计学差异（P＜0.05）。另外,联合组细胞克隆数少于雷帕霉素组和干扰组,且有统计学差异（P＜0.05）。流式细胞仪分析表明,对照组、雷帕霉素组、干扰组、联合组的G2/M期细胞比例分别是:6.86±0.34%、8.43±0.45%、11.30±1.16%、18.33±1.24%。干扰组、雷帕霉素组、联合组的G2/M期细胞比例明显较对照组高,且干扰组、联合组与对照组比较有统计学差异（P＜0.001）,联合组与干扰组、雷帕霉素组比较,有统计学差异（P＜0.001）。对照组、雷帕霉素组、干扰组、联合组的凋亡细胞比例分别是:11.47±2.68%、24.47±1.90%、24.33±2.70%、45.63±3.05%。联合组、干扰组和雷帕霉素组的细胞凋亡比例明显较对照组多,其中联合组的凋亡细胞比例最多,且联合组、干扰组、雷帕霉素组与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）。干扰组、雷帕霉素组与联合组比较也有统计学差异（P＜0.05）。蛋白印迹分析显示,pP53、CDK1蛋白在雷帕霉素组、干扰组、联合组细胞中的表达较对照组细胞的低,其中联合组的表达最低,而P53在各组的表达差异不明显。Bcl-2蛋白在雷帕霉素组、干扰组、联合组细胞中的表达较对照组细胞的低,其中联合组的蛋白表达最低。Bax蛋白表达在雷帕霉素组、干扰组、联合组细胞中的表达较对照组细胞的高,且联合组的表达最高。结论:FAM135B调控下游PI3K/AKT/mTOR信号传导通路。下调FAM135B的表达,可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活,这可能是提高食管鳞癌细胞放射敏感性的机制之一。雷帕霉素和下调FAM135B表达,在提高食管鳞癌细胞放射敏感性、调节细胞周期蛋白表达和诱导细胞凋亡方面具有协同作用。第三部分:RNA干扰FAM135B对食管癌放射敏感性影响的体内研究目的:探讨siRNA敲低FAM135B表达后,对裸鼠移植瘤放射敏感性的影响。方法:利用 pLenti-U6-FAM135BsgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro 质粒,转染 KYSE150 食管癌细胞。利用敲低FAM135B表达的食管鳞癌细胞构建裸鼠移植瘤模型,将裸鼠随机分为 4 组:KYSE150 组（对照组）、KYSE150+8Gy RT 组（照射组）、KYSE150-FAM135B shRNA组（干扰组）和KYSE150-FAM135B shRNA+8Gy RT组（干扰照射组）,观察瘤体体积变化及各组的移植瘤重量差异。利用免疫组化法,分析移植瘤组织中FAM135B、CDK1、Bcl-2 和 Bax 蛋白表达情况。结果:利用pLenti-U6-FAM135BsgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro 质粒,成功转染了 KYSE150 食管癌细胞,获得了稳定的低表达FAM135B蛋白的KYSE150-FAM135B shRNA细胞。照射组、干扰组和干扰照射组的移植瘤肿瘤体积增长在辐照6天后增长速度减慢。照射15天后对照组、照射组、干扰组和干扰照射组的移植瘤重量分别是1.75±0.16g、1.25±0.18g、1.29±0.14g、0.74±0.09g,其中干扰组、照射组和干扰照射组瘤体的重量,与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）,干扰照射组瘤体重量与干扰组、照射组的比较,有统计学差异（P＜0.05）。免疫组化结果显示,干扰组和干扰照射组中,FAM135B、CDK1、Bcl-2蛋白表达较对照组下降,Bax蛋白表达较对照组增强。结论:敲低FAM135B的表达,可提高移植瘤对放射治疗的敏感性。