麻疯树的高效再生和基因转化研究

来源 :中南林业科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhizu81748
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麻疯树是一种重要的能源植物,但是麻疯树种植区域狭窄,产量低限制了其作为能源植物进行大规模栽培和产业化。通过基因工程的方法可以改良麻疯树的抗性、产量、油质等性状,从而扩大麻疯树分布范围,增加结实产量、增加麻疯树种子含油量、改良油质。而麻疯树的遗传改良需要建立高效再生(主要是叶盘再生)体系和转化体系。本研究建立了麻疯树叶盘高效再生体系,初步研究了农杆菌介导的麻疯树叶盘转化。本研究直接以温室中培养的一年生麻疯树为材料,通过增加BA和IBA的浓度以及调整两者比值,采用长时间暗培养的方法筛选出最佳不定芽诱导激素浓度为5mg·L-1BA,5mg·L-IBA。进一步研究了赤霉素对不定芽再生的影响,当赤霉素浓度为0.05 mg·L-1,麻疯树叶盘再生频率达到90.9%,比现有文献报道的先进水平(约56%)提高34.9%,平均不定芽个数达到4.6个。经过上述改进,提高了麻疯树植株的再生频率,从而建立了以麻疯树叶盘为外植体的高效的间接再生体系。虽然叶盘间接再生能取得较高的再生频率,但直接分化再生相对于间接再生周期短,操作简单,未经过脱分化而能保持遗传稳定性,转化外源基因也能稳定遗传。本研究继续以温室中一年生麻疯树为材料,采用正交实验的方法得出不定芽再生的最佳激素组合为1 mg·L-1TDZ,0.5 mg·L-1IBA,1.5 mg·L-1BA;测定了不定芽再生的硝普钠(SNP)效应,在SNP为2mg/L时能显著增加不定芽再生频率,在进一步培养中经过SNP处理的叶盘的平均不定芽再生个数极显著高于对照;发现了第四片展开叶再生频率最高。综合上述最佳条件,发现经过4周的培养,就可再生出大量不定芽,再生频率可以达到88%,比现有文献报道的先进水平(约53%)有显著的提高。经过上述改进,缩短了麻疯树叶盘直接再生时间,提高了麻疯树叶盘直接再生频率,从而建立了以麻疯树叶盘为外植体的高效直接再生体系。在建立麻疯树高效再生体系的基础之上,本研究以麻疯树叶盘为外植体对其进行基因转化研究。首先测定了卡纳霉素,潮霉素,除草剂和头孢霉素对麻疯树叶盘诱导愈伤组织的影响;然后研究不同的选择压力,预培养时间,菌液OD值以及侵染时间对转化的影响;并且通过GUS染色发现抗性愈伤组织中的一部分呈现蓝色,说明被转化基因在细胞中得到了表达。对愈伤组织转化成功地获得了抗性不定芽。
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