研究背景与研究目的胶质瘤(Glioma)是发病率最高的颅内原发性肿瘤,目前主要临床治疗手段包括手术、放疗与化疗,但患者预后较差。多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)患者治疗后的中位生存期不超过15个月。根据世界卫生组织(WHO)标准,人类胶质瘤可以分为I-IV级,其中III-IV级胶质瘤的恶性程度高、侵袭性强。恶性胶质瘤治疗失败的主要原因是局部肿瘤复发,其中辐射耐受或辐射抵抗是放疗后肿瘤复发的重要根源之一。以往资料表明,肿瘤辐射耐受的产生原因与肿瘤干细胞的存在、肿瘤微环境和DNA损伤修复水平等因素密切相关。因此,深入研究阐明胶质瘤干细胞的辐射生物效应、及其关键的分子机制问题十分重要,也是探索建立靶向肿瘤干细胞的肿瘤临床放射治疗新策略的重要途径。研究表明,Wnt信号是干细胞增殖和分化的重要调控因子,Wnt/β-catenin信号通路在胶质瘤中高度活跃,提示其与人类胶质瘤发生有关。以往的研究资料多集中于高剂量电离辐射对于胶质瘤细胞的杀灭作用,尚缺乏针对胶质瘤细胞与肿瘤干细胞的低剂量辐射生物效应的研究。结合以往文献和课题组针对神经干细胞低剂量辐射刺激作用的线索,我们推测(Hypothesis)低剂量辐射可能通过诱导Wnt信号激活,刺激胶质瘤细胞或干细胞样细胞的增殖、促进肿瘤生长,具有重要的研究价值。因此,本研究应用u251人胶质瘤细胞,采用细胞分散培养和克隆培养技术,建立低剂量辐射的细胞模型和种植瘤动物模型,给予wnt信号通路选择性抑制剂干预处理方法,着重研究阐明低剂量辐射对胶质瘤细胞(或肿瘤干细胞样细胞)的增殖活力和肿瘤生长作用、及其wnt/β-catenin信号通路激活的参与机制问题。研究方法1.体外细胞培养方法采用含血清培养基和无血清培养基,分别进行u251人胶质瘤细胞系的分散培养和干细胞样克隆培养。2.体内种植瘤方法将u251细胞或干细胞样细胞种植于裸鼠皮下,观察肿瘤的形成、生长及肿瘤增殖等相关指标变化。3.低剂量辐射细胞模型采用低剂量(0.3gy、0.6gy)x-线电离辐射处理胶质瘤细胞,观察对肿瘤细胞增殖和生长的影响。4.wnt信号抑制剂干预采用wnt信号通路抑制剂iwr-1给药处理,分析wnt信号激活参与胶质瘤细胞或干细胞样细胞增殖过程的作用。5.细胞活力检测采用mtt方法和克隆形成实验,比较分析不同处理条件下胶质瘤细胞或干细胞样细胞的细胞活力和细胞增殖。6.免疫细胞化学方法采用组织和细胞的免疫荧光染色方法,观察胶质瘤细胞的增殖、分化和wnt信号通路的相关分子在胶质瘤细胞中的定位情况。7.westernblot方法采用蛋白印迹定量方法,观察分析培养细胞和肿瘤组织的wnt信号通路等相关蛋白分子的表达水平与变化情况。研究结果1.u251人胶质瘤细胞增殖、克隆生长和wnt/β-catenin信号通路分子的定位建立u251细胞分散培养、干细胞样克隆培养体系,采用免疫荧光染色观察cd133(肿瘤干细胞标志物)、gfap(星形胶质细胞分化标志物)、ki-67(细胞增殖标志物)、nestin(神经干细胞标志物)、brdu(细胞核增殖掺入标记物)、wnt信号通路相关蛋白分子的细胞定位。结果表明:多数u251细胞呈梭形或椭圆形、增殖和生长活跃,具备cd133强阳性和gfap弱阳性染色;无血清培养5-7天可获得干细胞样克隆球,克隆球细胞呈现ki-67和nestin强阳性染色;胶质瘤细胞具有wnt1、wnt3a、wnt5a、β-catenin的阳性定位。该结果证明u251胶质瘤细胞能够表达肿瘤干细胞分子标记,增殖活跃,具有丰富wnt信号通路相关蛋白的表达定位特点。2.低剂量辐射刺激胶质瘤细胞增殖、克隆生长作用及其wnt信号通路干预效应采用mtt、克隆形成、划痕迁移实验、以及ki-67和pcna等细胞增殖指标的检测,观察分析胶质瘤细胞活力和增殖。结果表明:与对照组相比,低剂量辐射能够显著刺激胶质瘤细胞活力与增殖、促进克隆球形成、增加ki-67及pcna表达水平。给予wnt信号抑制剂iwr-1处理抑制低剂量辐射胶质瘤细胞增殖、迁移和克隆形成的刺激效应。该结果说明,低剂量辐射能够刺激胶质瘤细胞(或肿瘤干细胞样细胞)增殖和迁移,wnt信号激活介导了低剂量辐射的细胞生物刺激效应。3.低剂量辐射对体内种植胶质瘤生长的刺激作用与wnt信号通路干预效应通过裸鼠皮下注射u251细胞或胶质瘤干细胞样细胞建立种植瘤模型,在细胞注射后第4、7、10、13、16、19、22天,观察种植瘤的形成、生长、形态和ki-67免疫染色。结果表明:细胞注射后第13-22天能够形成明显的种植瘤;与对照组相比,低剂量辐射能够促进种植瘤的大小、体积、重量和增加ki-67阳性细胞数目;而wnt信号抑制剂iwr-1处理能够阻止低剂量辐射的刺激效应。该结果说明低剂量辐射能够刺激种植肿瘤的形成和生长,而wnt信号途径的异常激活参与这一生物效应过程。4.低剂量辐射刺激胶质瘤细胞增殖和肿瘤生长作用的相关细胞内信号通路分析采用24h/48h细胞培养样本和第22天移植瘤组织样本,westernblot检测wnt、akt、erk1/2和jnk信号分子表达和磷酸化水平,分析其功能活化状态。结果表明:与对照组相比,低剂量辐射引起wnt1、wnt2、wnt3a、wnt5a、β-catenin表达上调,p-β-catenin表达下调。同时,低剂量辐射组的akt、p-akt、erk1/2、p-erk1/2表达上调,jnk与p-jnk表达下调。给予wnt信号抑制剂iwr-1处理能够减轻或逆转上述蛋白分子表达的变化。该结果进一步证实了低剂量辐射刺激胶质瘤细胞增殖和肿瘤生长过程中,wnt信号异常激活与可能下游机制,提示akt和erk1/2信号途径激活可能共同参与胶质瘤低剂量辐射生物效应过程。但是,wnt信号通路与akt、erk1/2信号激活之间的确切关系与病理学意义,有待深入研究阐明。研究结论通过体外和体内实验研究,发现低剂量电离辐射能够产生刺激人胶质瘤细胞(或肿瘤干细胞样细胞)的增殖和肿瘤形成,而且Wnt/β-catenin信号通路的异常激活参与低剂量辐射刺激胶质瘤细胞(或肿瘤干细胞样细胞)和肿瘤生长的生物效应过程。该研究结果有助于我们深入认识胶质瘤的病理发生机理,为进一步探索靶向胶质瘤干细胞的放射治疗策略提供了新的实验证据,具有理论和应用意义。